удовлетворительных данных рекомендуется перед
гидролизом использовать
образцы белка/пептида массой более 500 нг.
МЕТОД 4. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С 6-АМИНОХИНОЛИЛ-
N-
ГИДРОКСИСУКЦИНИ-МИДИЛКАРБАМАТОМ
Предколоночная дериватизация аминокислот с 6-аминохинолил-
N-
гидроксисукцинимидилкарбаматом (АХК) проводится перед разделением смеси
аминокислот
методом
обращенно-фазовой
ВЭЖХ.
АХК
реагирует
с
аминокислотами с образованием стабильных флуоресцирующих несимметричных
производных мочевины (АХК-аминокислот), которые легко поддаются анализу
методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием.
Разделение АХК-производных аминокислот методом обращенно-фазовой
ВЭЖХ на колонке, заполненной силикагелем октадецилсилильным, достигается
подбором концентрации ацетонитрила и ионной силы буферного раствора.
Селективное флуоресцентное детектирование производных при длине волны
возбуждающего света 250 нм и при длине волны излучаемого света 395 нм
допускает прямой ввод реакционной смеси без каких-либо существенных
поправок на основной флуоресцирующий побочный продукт — 6-аминохинолин.
Избыток реактива быстро гидролизуется (t
1/2
< 15
с) с образованием 6-
аминохинолина,
N-гидроксисукцинимида и диоксида углерода, а через 1 мин
дальнейшее образование производных не происходит.
Площади пиков для АКХ-аминокислот, по
существу, не изменяются, по
меньшей мере, в течение 1 недели хранения растворов при комнатной
температуре. Следовательно, АХК-аминокислоты обладают более чем
достаточной стабильностью для проведения круглосуточного
автоматического
хроматографического анализа. Предел обнаружения для каждой аминокислоты,
кроме цистеина, находится в области от 40 фмоль до 320 фмоль.
Предел обнаружения для цистеина составляет около 800 фмоль.
Линейность сигнала наблюдается в области 2,5—500 мкмоль с коэффициентом
корреляции более 0,999. Для получения удовлетворительных данных
рекомендуется перед гидролизом использовать образцы белка/пептида массой
более 30 нг.
МЕТОД 5. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С О-ФТАЛЕВЫМ
АЛЬДЕГИДОМ
Предколоночная
дериватизация аминокислот с о-фталевым альдегидом
(ОФА) проводится перед разделением смеси аминокислот методом обращенно-
фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием. Метод не позволяет
определять аминокислоты, являющиеся вторичными аминами (например,
пролин).
ОФА в присутствии тиольных соединений
реагирует с первичной
аминогруппой, образуя производные изоиндола с сильной флуоресценцией. В
качестве тиольных соединений могут быть использованы 2-меркаптоэтанол и 3-
меркаптопропионовая кислота. ОФА не обладает флуоресценцией и,
следовательно, не образует мешающих пиков. Кроме того, его растворимость и
стабильность в водном растворе, наряду с высокой скоростью реакции, позволяет
проводить автоматическую дериватизацию с использованием автодозатора для
смешивания испытуемого образца и реагента.
Основным недостатком ОФА
является отсутствие у него способности реагировать со вторичными
аминокислотами (например, пролином). Компенсировать данный недостаток
можно сочетанием с методиками, описанными в методах 7 или 8.
Предколоночная дериватизация аминокислот с ОФА используется для
пробоподготовки перед обращенно-фазовой ВЭЖХ. Так как ОФА-производные
аминокислот неустойчивы, анализ и разделение
методом ВЭЖХ проводят
немедленно после дериватизации. Хроматограф для жидкостной хроматографии
должен быть оснащен флуометрическим детектором для обнаружения
производных аминокислот. Интенсивность флуоресценции ОФА-производных
аминокислот измеряют при длине волны возбуждающего света 348 нм и длине
волны излучаемого света 450 нм.
Заявленный предел обнаружения при флуориметрическом детектировании
не ниже 50 фмоль, однако на практике предел обнаружения составляет 1 пмоль.
МЕТОД 6. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С (ДИМЕТИЛАМИНО)-
АЗОБЕНЗОЛСУЛЬФОНИЛХЛОРИДОМ
Предколоночная
дериватизация
аминокислот
с
(диметиламино)азобензолсульфонилхлоридом
(ДАБС)
проводится
перед
Do'stlaringiz bilan baham: