“амалий молекуляр зоология” Маърузачи: б ф. д., проф. Абдурахим Эргашевич кучбоев

“АМАЛИЙ МОЛЕКУЛЯР ЗООЛОГИЯ” Маърузачи: б.ф.д., проф. Абдурахим Эргашевич КУЧБОЕВ  

ЎЗБЕКИСТОН РЕСПУБЛИКАСИ
ОЛИЙ ВА ЎРТА МАХСУС ТАЪЛИМ ВАЗИРЛИГИ
ЎЗБЕКИСТОН МИЛЛИЙ УНИВЕРСИТЕТИ
БИОЛОГИЯ ФАКУЛЬТЕТИ
Зоология кафедраси

10-МАВЗУ. СЕКВЕНИРЛАШ – ДНКНИНГ БИРЛАМЧИ НУКЛЕОТИДЛАР КЕТМА-КЕТЛИГИНИ АНИҚЛАШ. НУКЛЕОТИДЛАР КЕТМА-КЕТЛИГИ АСОСИДА ОРГАНИЗМЛАРНИ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ҚИЛИШ

РЕЖА:

• РЕЖА:
• ПЗР-амплификациянинг асимметрик реакциясини флуоресцент нишонли нуклеотидлар ёрдамида ташкил этиш (секвенирлаш реакцияси)
• ПЗР-амплификация реакциясидаги асимметрик фрагментларни тозалаш
• Blastn программаси ёрдамида кўплаб текислаш ишларини олиб бориш.

ПЗР-амплификациянинг асимметрик реакциясини флуоресцент нишонли нуклеотидлар ёрдамида ташкил этиш (секвенирлаш реакцияси) 

• ПЗР-амплификациянинг асимметрик реакциясини флуоресцент нишонли нуклеотидлар ёрдамида ташкил этиш (секвенирлаш реакцияси) 
• Молекуляр генетиканинг ривожланиши биотехнологиянинг тараққиёти учун катта туртки бўлиб хизмат қилди. Ушбу йўналишнинг негизида янги маҳсулотни яратиш ёки аввалдан маълум бўлган маҳсулотни генетик материални кўчириб ўтказиш йўли билан олиш масаласи ётади. Ҳозирги даврда биотехнология турли биологик фаол моддаларни саноат асосида ишлаб чиқарилишида кенг қўлланилмоқда (Venter et al., 2001; Glick, Pasternak, 2002).
• Маҳаллий адабиётларда нуклеин кислоталарни кетма-кетлигини расшифровка қилиш секвенирлаш деб аталади (ингл. Sequencing – кетма-кетликни аниқлаш). Ҳозирги вақтда секвенирлаш (автоматик секвенатор) Сэнджер усулида бўлиб, кенг тарқалган, бу
• Автоматик ДНК секвенирлаш принципи аниқ вақт тартибида флуроцентланган маҳсулотларни электрофоретик ажратиш, ўзига хос терминация секвенирлаш реакциялари ва уларнинг детекциясинии ўз ичига олади (Inoue el al., 1998). Детекция гельнинг пастки қисмида, ДНК қисмларининг лазер нури ёрдамида бўёқ молекулалари қўзғалиши натижасида амалга оширилади. Ажратиш махсус мослама, автоматик ДНК секвенатори ёрдамида амалга оширилади. Биринчи автоматик ДНК секвенатори 1987 йил Applied Biosystems фирмаси томонидан ишлаб чиқилган.
• учун кўпгина коммерсияли наборлар ишлаб чиқарилмоқда.

Фредерик Сэнджер – англиялик биохимик, икки марта химия бўйича Нобель мукофоти лауреати: Инсулинда аминокислоталар кетма-кетлигини аниқлагани учун (1955 й.) ва ДНКни секвенирлаш усулин ишлаб чиқаргани учун (1980 й.)

• Фредерик Сэнджер – англиялик биохимик, икки марта химия бўйича Нобель мукофоти лауреати: Инсулинда аминокислоталар кетма-кетлигини аниқлагани учун (1955 й.) ва ДНКни секвенирлаш усулин ишлаб чиқаргани учун (1980 й.)

Автоматик ДНК секвенатори махсус компьютер дастурлари ёрдамида бошқарилади. Масалан, Applied Biosystems фирмаси мосламаси йиғиш дастури ва маьлумот таҳлили билан бирга қўшилади. Электрофоретик бўлиниш тугаллангандан сўнг, Data Collection дастури ёрдамида олдиндан йиғилган маьлумотлар ўзига хос дастур ёрдамида таҳлилга юборилади. Бунда у ёки бу нуклеотидлар асосидаги терминантланган ДНКнинг тегишли фрагментларининг нисбий баландик чўққиси аниқланади ва бузилганлари олиб ташланади (Alphey, 1997).

• Автоматик ДНК секвенатори махсус компьютер дастурлари ёрдамида бошқарилади. Масалан, Applied Biosystems фирмаси мосламаси йиғиш дастури ва маьлумот таҳлили билан бирга қўшилади. Электрофоретик бўлиниш тугаллангандан сўнг, Data Collection дастури ёрдамида олдиндан йиғилган маьлумотлар ўзига хос дастур ёрдамида таҳлилга юборилади. Бунда у ёки бу нуклеотидлар асосидаги терминантланган ДНКнинг тегишли фрагментларининг нисбий баландик чўққиси аниқланади ва бузилганлари олиб ташланади (Alphey, 1997).

Секвенирлаш реакциясидаги ПЗР босқичлари учун мўлжалланган реациялар аралашмаси таркиби.

Реакция компонентлари	Ҳажми, мкл
2,5X Ready Reaction Premix	0,5
TMS Buffer 5X	3,75
3,3 мкМ Праймер	1
ДНК	1
Бидистиллирланган сув	13,75
Реакциянинг якуний ҳажми	20

Секвенерлаш реакциясини ўтказишда температуралар даври тартиби.

Температура	Вақт	Босқичлар таснифи таснифиОписание этапа
96° С	1 мин	дастлабки қиздириш
96° С	10 сек	35 давр денатурация
55° С	50 сек	юмшатиш
60° С	4 мин	синтез
10° С		сақлаш

35 давр

BioEdit дастури ёрдамида секвенс храмотограммаси намунаси.

BLAST асосий ойнаси.