|
Xulosa va tavsiyalar.
PDB ma'lumotlar bazasida va ESTHER ma'lumotlar bazasida a/b-hidrolaza qatlamli oqsillar oilasi uchun ketma-ketlik homologiyasi qidiruvi (http://bioweb.ensam.inra.fr/ESTHER/general?what=index) (Hotelier va boshq., 2004) mos ravishda PSI- va PHI-BLAST va BLASTP dasturlari yordamida amalga oshirildi. EstA strukturasi AMoRe (Navaza, 1994) bilan molekulyar almashtirish usuli bilan, qidiruv modeli sifatida, kristalli G. kandidum lipazaning N-terminal qoldiqlari 1-395 (qo'shilish kodi) ni ulash orqali ishlab chiqilgan kimera shablonidagi koordinatalardan foydalangan holda hal qilindi. : 1THG [Schrag va Cygler, 1993]) kristalli sichqonchani asetilkolinesterazasining (AChE) C-terminal qoldiqlari 384-543 (kirish kodi: 1MAA [Bourne va boshq., 1999]). Ushbu protsedura 15-4 Å o'lchamlari oralig'ida 19% korrelyatsiya koeffitsientini va 49,7% R omil qiymatini berdi. 1028 ta qoldiqdan 1005 tasi (polipeptid zanjirining 98%) hech qanday qo'l aralashuvisiz qurilgan va ARP/wARP yordamida mos ravishda 20,3% va 28,5% R faktor va Rfrsiz qiymatlarigacha tozalangan (Perrakis va boshq., 1999). ARP/wARP modelining yakuniy takomillashtirish bosqichlari REFMAC (Murshudov va boshq., 1997) yordamida 30 va 2,1 Å oralig'idagi ma'lumotlardan foydalangan holda amalga oshirildi; natijada olingan SigmaA vaznli 2Fo-Fc va Fo-Fc elektron zichligi xaritalari dastlabki ketma-ketlikdagi xatolarni aniqlash va TURBO-FRODO grafik dasturi yordamida modelni tuzatish uchun ishlatilgan (Roussel va Cambillau, 1989).
Yakuniy EstA tuzilmasi assimetrik birlikdagi 2 molekulaning har biri uchun Ser22/Gln26 dan Val538 qoldiqlarini, 2 ta toʻliq boʻlmagan ikki antennali N-bogʻlangan glikan zanjirlarini, GlcNAc2Man3GlcNAc2, 2 GlcNAc2 disaxaridlarini, NA15 molekulalarini va molekulyar molekulalarni oʻz ichiga oladi. , va 2 sulfat va 1 xlorid ionlari. Asimmetrik birlikdagi ikkita molekula orasidagi o'rtacha ildiz-o'rtacha kvadrat og'ish 513 Ca atomi uchun 0,15 Å ni tashkil qiladi. Strukturaning stereokimyosi PROCHECK bilan tahlil qilindi (Laskowski va boshq., 1993); taxminiy katalitik Ser210 bundan mustasno, Ramachandran uchastkasining ruxsat etilmagan hududlarida hech qanday qoldiq topilmadi.
Elektrostatik sirt potentsiallari GRASP (Nicholls va boshq., 1991) yordamida 100 mM tuz konsentratsiyasi, ichki va tashqi dielektrik doimiylari mos ravishda 2 va 80 va Uning qoldiqlari bo'yicha o'rtacha zaryad 0 dan foydalangan holda hisoblangan; sichqoncha AChE (Bourne va boshq., 1999) bo'yicha qiyosiy hisob-kitoblar bir xil parametrlardan foydalangan. Raqamlar ESPript (Gouet va boshq., 1999), SPOCK (Kristofer, 1998) va Raster3D (Merritt va Bekon, 1997) yordamida yaratilgan.
Asil p-nitrofenil (pNP) substratlarida (suvli eritmalarda 0,25 mM) esteraza faolligi 25 mM sitrat tamponida, pH 4,5 yoki 25 mM fosfat tamponida, pH 6,0da amalga oshirildi; reaktsiya to'xtatildi va pH Na2CO3 bilan 9-9,5 ga keltirildi va ajralib chiqqan fenol spektrofotometriya (l = 405 nm) bilan miqdori aniqlandi. Suvda erimaydigan palmitat va stearat esterlari uchun eritmalar (25 mM) asetonitrilda edi. Lipaza faolligi va sinnamoil va feruolil esteraza faolligi Sommer va boshqalar tomonidan ta'riflanganidek tekshirildi. (1997) va Donaghy va boshqalar. (1998), mos ravishda. Karboksilik efir eritmalari va emulsiyalarning gidrolizi pH statistik (TTT 80 Radiometer, Kopengagen, DM), 25 ° C da va 30 ml 2,5 mM Tris, pH 5,0, 0,1 M NaCl da va EstA konsentrasiyalari yordamida potentsiometrik tarzda kuzatildi. 0,1-0,5 mkg ml-1 diapazoni (1-6 nM, 80 kDa massaga asoslangan). Vinil esterlar va triatsilgliserollarning ortib borayotgan kontsentratsiyasida ferment faolligini o'lchash uchun standart sharoitlar ishlatilgan (Chahinian va boshq., 2000). Karboksilik efirlarning to'yingan eritmalariga nisbatan faollikni o'lchash uchun hech qanday detarjan yoki emulsifikator qo'shilmagan. Chiqarilgan yog 'kislotalari 0,1 M NaOH bilan titrlangan. Sirka, propion yoki butir kislotasining pH 5,0 va 25°C da qisman dissotsiatsiyasi uchun tuzatish kiritildi (tegishli pKa qiymatlari: 4,75, 4,87 va 4,87). Katalitik doimiy (kcat) qiymatlari EstA uchun 80 kDa va cho'chqa jigari esterazasi va Electrophorus electricus AChE (Sigma-Aldrich) uchun 60 va 80 kDa massalardan foydalangan holda, substratning optimal konsentratsiyasida qayd etilgan maksimal tezliklar (Vm) qiymatlaridan hisoblab chiqilgan. Michaelis doimiysi (Km) qiymatlari kinetik ma'lumotlarning ikki tomonlama o'zaro Lineweaver-Burk chizmalaridan grafik tarzda aniqlandi.
EstA gomologlarining bashorat qilingan ketma-ketligi Uaytxed instituti/Massachusets texnologiya instituti (MIT) Genom tadqiqotlari markazi (N. crassa, M. grisea, A. nidulans va F. graminearum) yoki Milliy Biotexnologiya Axborot Markazi (NCBI) eukaryotik genom ma'lumotlar bazasidan (A. fumigatus va C. posadasi). Olingan oqsil ketma-ketligi MULTALIGN (Korpet, 1988) yordamida tekislangan.
Biz ushbu loyiha tashabbuskori (AFMB) ga minnatdorchilik bildiramiz;
Do'stlaringiz bilan baham: |
