Alfa/beta-gidrolaza qatlam fermentlarining bioinformatik tahlili

Jadval 1. Ushbu tadqiqotda ishlatiladigan plazmidlar.
Qisqacha aytganda, pWD002, pWD024 va pWD025 mos ravishda KmYME, NP_011545 va NP_011529 ning buzilish kassetasi uchun yaratilgan. pWD004 EGFP ifodasi uchun tuzilgan; pWD005 va pWD006 KmYME lokalizatsiya tahlilida KmYME-EGFP va KmCox-RFP ifodasi uchun tuzilgan. pWD007, pWD008 va pWD009 kesilgan KmYME (1-20 aa) -EGFP, KmYME (1-40 aa) -EGFP va KmYME (41-360 aa) -EGFP ifodasi uchun mitoxondriyal signal peptidini aniqlash uchun tuzilgan. pWD026 KmYME buzilgan va buzilmagan shtammlarning mitoxondrial morfologiyasini kuzatish uchun URA3 yorlig'i bilan KmCox-RFP ifodasi uchun yaratilgan. pWD010, pWD034 (pWD010 dan GYSLG→GHSMG) va pWD035 (pWD010 dan GYSLG→AYALA) E. coli BL21 (DE3) hujayralarida T7 promouteri ostida KmYME va KmYME mutantlarini ifodalash uchun tuzilgan. pWD003, pWD032 (pWD003 dan GYSLG→GHSMG) va pWD033 (pWD003 dan GYSLG→AYALA) K. marxianusda ScGAPDH promouteri ostida KmYME va KmYME mutantlarini ortiqcha ifodalash uchun ishlatilgan.
Ushbu tadqiqotda ishlatiladigan barcha xamirturush shtammlari 2-jadvalda keltirilgan va Qo'shimcha 1-faylda tasvirlangan: Qo'shimcha S3-rasm. Transformatsiya lityum asetat usuli yordamida amalga oshirildi (Abdel-Banat va boshq., 2010). Transformantlar tegishli qo'shimchalar bilan SD muhitida skrining qilindi va shablon sifatida genomik DNK yordamida PCR tomonidan tasdiqlandi.

3. 
   Alfa/Beta-gidrolaza qatlamli fermentlar: tuzilmalar, funktsiyalar va mexanizmlar
   

Aspergillus niger qo'ziqorinidan biz a/b-gidrolaza qatlamlarining superoilasi a'zosi, ammo substrat o'ziga xosligi noma'lum bo'lgan EstA proteinini kodlovchi yangi genni aniqladik. EstA haddan tashqari ifodalangan va uning kristall tuzilishi lipaz-asetilxolinesteraza kimera shablonidan foydalangan holda molekulyar almashtirish orqali hal qilindi. EstA ning 2,1 Å o'lchamlari strukturasi katta erituvchi kirishi mumkin bo'lgan piyola shaklidagi bo'shliqning pastki qismidagi kichik cho'ntakda joylashgan kanonik Ser/Glu/Uning katalitik triadasini ochib beradi. Qo'lda o'rnatish protseduralari bilan tanlangan potentsial substratlar EstA faoliyati uchun tahlil qilindi. Cho'ntak geometriyasiga muvofiq, qisqa asil/propil zanjirli substratlarning gidrolizlanishiga ustunlik berildi. Boshqa zamburug'lar genomidan yaqin homologlarni aniqlash, ularning ba'zilari keng tarqalgan patogenlar, EstA ni superoilada qo'ziqorin esterazlarining yangi sinfining birinchi a'zosi sifatida belgilaydi. Shunday qilib, EstA tuzilishi uning patogen gomologlariga qaratilgan yangi antifungal vositalarni loyihalashda etakchi shablonni tashkil qiladi.Alfa/beta-gidrolaz qatlamli fermentlar oilasi tez sur'atlar bilan turli katalitik funktsiyalarga ega bo'lgan tizimli bog'liq fermentlarning eng katta guruhiga aylanmoqda. Bu oila a'zolariga atsetilxolinesteraza, dielakton gidrolaza, lipaz, tioesteraza, serin karboksipeptidaza, prolin iminopeptidaza, prolin oligopeptidaza, haloalkan degalogenaza, haloperoksidaza, epoksid gidrolaza, gidroksinitril liza va boshqalar kiradi. Fermentlarning barchasi turli xil kimyoviy tarkibga yoki fizik-kimyoviy xususiyatlarga ega bo'lgan substratlarda va turli biologik kontekstlarda samarali ishlash uchun rivojlangan nukleofil-uning-kislota katalitik triadasiga ega. Masalan, atsetilxolin esteraza fermentning faol joyiga substratning diffuziya chegarasiga yaqin tezlikda atsetilxolin neyrotransmitterining parchalanishini katalizlaydi. Dienelakton gidrolaza aromatik birikmalarni parchalash uchun substrat yordamida katalizdan foydalanadi. Lipazalar neytral suvda erimaydigan ester substratlarining suv/lipid interfeysida adsorbsiyalangan holda harakat qiladi. Ko'pgina lipazlar o'zlarining faol joyini ikkinchi darajali tuzilish elementlari ostida ko'milgan, qopqoqqa ega bo'lib, substratning faol joyiga kirishiga imkon berish uchun konformatsiyasini o'zgartirishi kerak. Tioesterazlar bioluminissensiya, yog 'kislotalari va poliketidlar biosintezi va metabolizmi kabi ko'plab biokimyoviy jarayonlarda ishtirok etadi. Serin karboksipeptidazalar peptid substratlarining manfiy zaryadlangan karboksilat uchini taniydilar. Haloalkan degalogenaza detoksifikatsiya qiluvchi ferment bo'lib, galogenlangan alifatiklarni tegishli spirtlarga aylantiradi, haloperoksidaza esa organik birikmalarning galogenlanishini katalizlaydi. Gidroksinitril liaz o'simliklarda mudofaa mexanizmi sifatida siyanogidrinlardagi uglerod-uglerod aloqalarini bir vaqtning o'zida vodorod siyanid hosil bo'lishi bilan ajratadi. Ushbu maqola tanlangan misollarni muhokama qilish orqali ushbu fermentlar oilasi uchun qayd etilgan katalitik faolliklarning umumiy ko'rinishini beradi. Katalizning molekulyar asoslari va substrat o'ziga xosligi haqidagi bilimlarning hozirgi holati ko'rsatilgan. Faol sayt anatomiyasi, topologiyasi va oqsil molekulasidagi konformatsion o'zgarishlar o'rtasidagi munosabatlar ferment ta'sir mexanizmi kontekstida muhokama qilinadi. Saprofit qo'ziqorin Aspergillus niger tabiatda keng tarqalgan bo'lib, u organik moddalarda aerob holda o'sadi va tuproqda, axlatda va kompostda uchraydi. U shuningdek, chirigan o'simlik materialida uchraydi, bu erda o'simlik hujayra devorlaridan polisaxaridlarni monomer birikmalarga aylantiradi. Ushbu polisaxaridlar asosan tsellyuloza va ksilandan iborat va murakkab matritsa hosil qilganligi sababli, degradatsiya polisakkaridazalar spektrini talab qiladi, masalan, pektinazlar, tsellyulazalar va hemiselülazalar (de Vries va boshq., 2002). Asosan D-glyukoza yoki D-ksiloza kabi monosakkaridlar bo'lgan mahsulotlar qo'ziqorin tomonidan metabollanadi. A. Nigerda transkripsiya regulyatori XlnR nafaqat tsellyuloza va ksilan asosiy zanjirlarini buzuvchi hujayradan tashqari tsellyulolitik va ksilanolitik fermentlarning ifodalanishini nazorat qiladi van Peij va boshqalar. 1998a, van Peij va boshqalar. 1998b, shuningdek, polisakkarid magistralining yon guruhlarini o'zgartiradigan atsetil ksilan va feruoyl esterazlar kabi yordamchi fermentlar (van Peij va boshq., 1998b). Hujayra ichidagi D-ksiloza reduktaza ifodasini nazorat qilish orqali XlnR ham D-ksiloza metabolizmida ishtirok etadi (Hasper va boshq., 2000).

A. niger patogen bo'lmagan qo'ziqorin deb hisoblanadi, ammo og'ir kasallik yoki immunosupressiv davoga ega bo'lgan bemorlar qo'ziqorin rivojlanishiga yordam berishi mumkin. Bundan farqli o'laroq, tegishli A. fumigatus turlari ko'plab epidemiologik tadqiqotlar mavzusi bo'lgan muhim va opportunistik inson patogenidir. Bu rivojlangan mamlakatlarda invaziv o'pka aspergillozi deb nomlanuvchi o'limga olib keladigan havo orqali yuqadigan qo'ziqorin infektsiyalarining eng tez-tez uchraydigan sababi bo'lib, immunitet tanqisligi bo'lgan bemorlarda o'limga olib keladigan mikozdir (Xan va boshq., 2003). Aspergilloz, kriptokokkoz, kandidoz, koksidioidomikoz, gistoplazmoz va blastomikoz kabi qo'ziqorinli pnevmoniyalar immuniteti pasaygan xo'jayinlar orasida kasallanish va o'limning asosiy sabablaridan biridir. Invaziv mikozlarning ko'payishi va og'irligi amfoteritsin B ni almashtirishga qaratilgan yangi antifungal strategiyalarga olib keldi, bu endi turli qo'ziqorin infektsiyalari uchun oltin standart emas. Har xil mog'orlarga qarshi in vitro va in vivo faolligini ko'rsatadigan vorikonazol va kaspofunginni tasdiqlash yaqinda yangi davolash usullarini joriy etdi Gupta va Tomas 2003, Kartsonis va boshqalar. 2003 yil.

A. niger XInR transkripsiya faollashtiruvchisi nazorati ostida bo'lgan protein omillarini aniqlashga qaratilgan tadqiqotlarimiz davomida biz noma'lum biologik funktsiyaning taxminiy, 538 qoldiq EstA oqsilini kodlaydigan yangi estA genini topdik. Ketma-ketlikni moslashtirish EstA ko'plab lipazlar va esterazlar uchun umumiy bo'lgan a/b-hidrolaza katlamini baham ko'rishini ko'rsatdi va funktsional katalitik triada mavjudligini taklif qildi. EstA biologik funktsiyasini tushunish uchun biz EstA ni haddan tashqari ifodaladik, tozaladik va kristallashtirdik. EstA ning 2,1 Å rezolyutsiyali kristall tuzilishi uning oqsillarning a/b-gidrolaza qatlamlari superoilasiga tegishli ekanligini tasdiqlaydi va erituvchiga to‘liq kirish mumkin bo‘lgan katta, piyola shaklidagi bo‘shliqning pastki qismida joylashgan Ser210/Glu338/His440 katalitik triadasini ochib beradi. EstA substratining o'ziga xosligi kremniyda ham, eritmada ham tekshirildi. Bundan tashqari, EstA ning yaqin homologlari boshqa qo'ziqorin turlarining tugallanmagan genomlaridan aniqlangan, ularning ba'zilari keng tarqalgan patogenlardir. Bizning tarkibiy, biokimyoviy va hisoblash ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, EstA qisqa asil zanjirli substratlarga nisbatan sezilarli o'ziga xos xususiyatga ega va uni oqsillarning a/b-gidrolaza qatlamlari superfamiliyasidagi qo'ziqorin esterazlarining yangi oilasining etakchi a'zosi sifatida aniqlaydi.
EstA genining ekspression tahlili va EstA ning biokimyoviy xarakteristikasi
EstA kodlash hududi genning birinchi 700 zarbasi ichida ikkita intronni o'z ichiga oladi (1-rasm). D-ksilozada yetishtirilgan yovvoyi turdagi A. niger shtammi, XlnR funksiyasini yo‘qotuvchi shtammi va xlnR ko‘p nusxali shtammi miseliyasidagi estA ifodasining Northern blot tahlili estA XlnR transkripsiyasi bilan tartibga solinishini tasdiqladi. faollashtiruvchi. 5'-GGCTAA-3' ketma-ketligiga ega bo'lgan bitta taxminiy XlnR bog'lanish joyi estA ning promotor hududida teskari yo'nalishda topildi, estA translatsiyani boshlash kodonidan 525 bp yuqorida. (A) Promotordagi taxminiy XlnR bog'lanish joyini, tarjimani boshlash joyini (TI), signal peptidini (SP) va uning kodlash ketma-ketligini va ikkita intronni, A (59 bp) va B ni ko'rsatadigan estA genining sxematik diagrammasi. (48 bp).
(B) A. niger yovvoyi tipdagi shtammida EstA transkripsiyasining shimoliy blot tahlili (Vt; strelka zaif bandga ishora qiladi), XlnR funksiyasini yo‘qotish shtammi (XlnR−) va xlnR ko‘p nusxali shtammi ( XlnR+).
EstA genini A. tubingensis dan kuchli endo-ksilanaz xlnA promouteri nazorati ostiga qo'yib, biz A. niger NW128 shtammida EstA ning ajratilgan shaklini muvaffaqiyatli oshirib yubordik. Keyin oqsil cheklangan miqdordagi differensial ammoniy sulfat cho'kmalari va anion almashinuvi yordamida bir hillikka tozalandi.
estA geni prognoz qilingan massasi 58,6 kDa bo'lgan 538 qoldiq polipeptid zanjirini kodlaydi. Hujayra osti nishon signallarini PSORT II qidiruvi dastlabki 16 ta qoldiqni o'z ichiga olgan N-terminal signal peptidini aniqladi (von Heijne, 1986). Bu tozalangan EstA ning Edmanning avtomatlashtirilgan ketma-ketligi bilan tasdiqlandi, u Leu17 ni qayta ishlangan oqsilning N-terminal qoldig'i sifatida aniq belgilab, nazariy massasi taxminan 522 qoldiq oqsilini berdi. 56,9 kDa va nazariy pI 4,73. Shunga qaramay, gel filtrlash va SDS-PAGE tahlillari, ular bitta cho'qqi va bitta chiziqni ko'rsatdi, ikkalasi ham taxminan taxminan ko'rinadigan massani ko'rsatdi. 80 kDa, ya'ni hisoblangan massadan 40% yuqori. Native-PAGE tarqoq bo'lsa ham, bitta diapazonga olib keldi va izoelektrik fokuslash pI 4,6-5,0 oralig'ida uchdan to'rttagacha intensiv va ikkita zaif diapazonni ko'rsatdi. Ushbu kuzatishlar (ma'lumotlar ko'rsatilmagan), ketma-ketlikda Asn-bog'langan glikanlar uchun oltita konsensus joylari mavjudligi (quyida qarang), EstA monomer, yuqori glikozillangan oqsil bo'lib, peptid zanjirida yoki zanjirida ozgina heterojenlikka ega ekanligini ko'rsatdi. posttranslational modifikatsiyadan kelib chiqadigan glikan qismlari.
EstA a/b-gidrolaza qatlamli oqsillar oilasiga kiradi
BLAST shablon sifatida EstA ketma-ketligidan foydalangan holda izlaydi, EstA ni a/b gidrolaza qatlamlari oilasining yangi a'zosi sifatida aniqladi (Cygler va boshq., 1993), uning bir nechta a'zolari kristallangan. Biroq, mavjud a/b-gidrolaza oqsili tuzilmalaridan birini shablon sifatida foydalanib, molekulyar almashtirish orqali EstA tuzilishini hal qilishga urinishlar muvaffaqiyatsizlikka uchradi. Shuning uchun EstA ketma-ketligining modulli tashkil etilishi hidrofobik klaster tahlili (HCA) (Callebaut va boshq., 1997) yordamida tahlil qilindi va tanlangan eng yuqori xitlarning HCA uchastkalari bilan solishtirildi. Eng yuqori modulli homologiyalar Torpedo californica atsetilxolinesteraza (AChE) (27% ketma-ketlik identifikatsiyasi) va Geotricum candidum lipazlari 1-2 (32% -33% ketma-ketlik identifikatsiyasi), a/a/ subfamiliyasidagi B tipidagi karboksilesteraza/lipazaning ikkita fermenti bilan topilgan. b-gidrolaza qatlamlari oilasi, ammo ular HCA uchastkalarining alohida hududlari bilan cheklangan. Ushbu kuzatish bizni kristalli G. kandidum lipaz molekulasining N-terminalining uchdan ikki qismini kristalli sichqonchaning AChE molekulasining C-terminal uchdan bir qismiga ulash orqali kimera shablonini loyihalashga undadi (Tajriba tartib-qoidalariga qarang). Ushbu kimera shabloni muvaffaqiyatli molekulyar almashtirish jarayoniga olib keldi. Yakuniy tuzilma 30-2,1 Å o'lchamlari oralig'ida 15,3% (Rfree, 18,0%) kristallografik R omil qiymatiga va yaxshi stereokimyoga ega (1-jadval). Yakuniy elektron zichlik xaritalarini tekshirish bizga siqish artefaktlari tufayli dastlabki estA ketma-ketligida bashorat qilinmagan, ammo keyin cDNKni qayta tartiblash bilan tasdiqlangan intron A ni aniqlashga imkon berdi (1-rasm) va chiqarilgan EstAdagi bir nechta noaniqliklarni tuzatish. ketma-ketlik. Faol sayt cho'ntagi ikkita pastki qismdan iborat bo'lib ko'rinadi: katalitik mexanizmni o'z ichiga olgan va Phe240, Trp301, Phe342 va Phe400 qoldiqlaridan tashkil topgan aromatik klaster bilan qoplangan asil cho'ntagi va ikkinchi bo'linma asosan qoldiqlardan iborat. qutbli, EstA tabiiy substrati bo'lishi mumkin 2-rasm, 3-rasm. EstA faol joyining erituvchiga to'liq kirishi va ushbu faol joy cho'ntagining chetida hidrofobik yamoqning yo'qligi, asosan, EstA ning esteraza emas, balki haqiqiy esteraza vazifasini bajarishini ko'rsatadi. lipaza.
EstA molekulyar yuzasida elektrostatik potentsiallarni tahlil qilish faol maydon bo'shlig'i ochilgan yuz uchun sezilarli ijobiy potentsialni va qarama-qarshi yuz uchun salbiy potentsialni aniqladi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Ushbu umumiy anizotrop taqsimot EstA ga faol joy bo'shlig'ining markaziy o'qi bo'ylab yo'naltirilgan vektor bilan sichqoncha AChE ning yarmiga teng dipol momentini beradi. Bundan tashqari, salbiy sirt potentsiali ko'pincha faol maydon bo'shlig'ining tashqi kirish qismini o'rab turgan halqa shaklini hosil qiladi. Agar EstA beshta glikan zanjirining ba'zilari sialillangan bo'lsa, EstA dipol momenti yanada sezilarli bo'ladi. Ushbu kuzatishlar nafaqat elektrostatik gradient AChE (Ripoll va boshq., 1993) uchun topilganidek, musbat zaryadlangan substratlar yoki boshqa kationlarni faol maydonga yo'naltirishi mumkinligini, balki EstA elektrotaktinlarning atipik sinfiga tegishli bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi (Botti va boshq. ., 1998), a/b-gidrolaza qatlamlari oilasida o'ziga xos sirt zaryadining taqsimlanishi va yopishqoqlik xususiyatlari bilan ajralib turadi. Ikkinchisi EstA glikanlarining yuqorida taxmin qilingan tan olinishi roliga mos keladi.
EstA ning biologik funktsiyasini tushunish va uni esteraza yoki lipaza sifatida aniqlash uchun EstA tanlangan substratlarda tahlil qilindi (4-rasmdagi kimyoviy tuzilmalarga qarang; 2-jadval). Esterazalar eruvchanlik chegarasidan ancha past konsentratsiyalarda qisqa zanjirli vinil esterlar va triatsilgliserinlar eritmalariga nisbatan maksimal faollikni namoyon qilsa, lipazlar emulsiyalangan substratlarga nisbatan maksimal faollikni namoyon etadi (Chahinian va boshq., 2002). EstA trioktanoin emulsiyalarida yoki zaytun moyida lipaz faolligini, sinnamoil, feruolil yoki pNP substratlarida esteraza faolligini aniqlamaydi. Aksincha, u vinil esterlar va triatsilgliserinlarni samarali gidrolizlaydi, kinetik parametrlari esteraza harakati va substratning o'ziga xosligi AChE ga o'xshash. Vinil esterlarni glitserinli substratlarga aniq afzal ko'radigan cho'chqa jigari esterazasidan farqli o'laroq, EstA spirt qismining tabiatini afzal ko'rmaydi; Buning o'rniga u atsetat > propionat >> butirat va triatsetin >> tripropionin > tributirin buyurtmalariga ega qisqa zanjirli atsil qismlarini afzal ko'radi. Optimal faollik pH 5,0-5,5 oralig'ida topilgan, bu qo'ziqorin metabolizmi uchun pH talabiga mos keladi. Ushbu ma'lumotlar EstA katalitik uchastkasi ikki uglerod atomidan uzunroq vinil/atsil zanjiri bo'lgan substratlarni joylashtira olmasligini ko'rsatadi va Phe342 va Phe400 yon zanjirlari katalitik His440ga hidrofobik muhitni beradi, bu ko'pincha faolligi bo'lgan boshqa gidrolazalarda kuzatiladi.