1. Вирусы возбудители болезней растений. Строение и размножение вирусов

9. Методы диагностики вирусов и вирусных болезней. Визуальная диагностика – наиболее простой метод. Хотя в ряде случаев и удается достоверно установить вирусную природу заболевания по его внешним признакам (например, кольцевые или линейные хлоротичные узоры на молодых листьях), их идентификация затруднена частым бессимптомным (латентным) характером развития болезней. Так, большинство промышленных сортов земляники являются скрытыми носителями вирусной инфекции. С другой стороны, вирусные симптомы сходны с симптомами неинфекционных болезней, вызванных недостатком (избытком) макро- и микроэлементов (азота, магния, железа, меди, хлора). Действие гербицидов, регуляторов роста на растения при неправильном применении также может быть сходно по симптоматике с вирусными болезнями.
Установление инфекционности заболевания во многих случаях предшествует остальным методам диагностики. Для установления инфекционности вирус нужно передать на здоровое растение. Чтобы определить вирусы, распространяющиеся контактно-механическим способом, проводят инокуляцию соком больного растения. Для этого растительный материал растирают в ступке, из растертой массы отжимают сок, фильтруют и осторожно втирают в лист молодого здорового растения. Через определенное время (5...20 дней) наблюдают за развитием симптомов. Универсальный метод передачи вирусной инфекции – прививка, когда больной привой (черешок листа, верхушка побега) прививают на здоровый подвой. Редко для передачи вирусов используют насекомых-переносчиков и растение-паразит – повилику.
Метод индикаторных растений – широко распространенный метод диагностики вирусных болезней и идентификации вирусов. Он основан на использовании тест-растений (индикаторных растений), дающих четкие, часто строго специфичные по отношению к определенному виду вируса симптомы. Заражение травянистых растений-индикаторов осуществляют механической инокуляцией соком. Заражение проявляется в виде местных некрозов, реже системной реакцией (изменение окраски, угнетение роста). Для вируса аспермии томата в качестве индикатора можно использовать молодые растения табака (Nicotianaglutinosa), для диагностики Х-вируса картофеля – амарант шаровидный (Gomphrenaglobosa). В редких случаях для заражения используют отдельные изолированные листья растений-индикаторов. Соконепереносимые вирусы переносят на индикаторные растения методом прививки.
Так, для диагностики вирусов земляники используют прививку черешком листа на индикаторные клоны земляники лесной (Fragariavesca). Серологический метод широко распространен при диагностике вирусов. Если теплокровному животному, например кролику, ввести в кровь очищенный препарат растительного вируса, иммунный аппарат животного в ответ на введение чужеродного белка (антигена) начнет вырабатывать специфичные этому белку антитела, связывающие его. С помощью специальных методик эти антитела можно выделить из сыворотки крови и использовать для определения вирусов непосредственно в соке растения. В последнее время разработаны методы, которые позволяют вырабатывать антитела в культуре invitro клеток животного. В результате реакции между антителом и антигеном образуется осадок (преципитат, или серум), различимый визуально или с помощью микроскопа. В основе связи антиген – антитело лежит принцип ключа и замка, то есть она очень специфична. Каждое определение необходимо проводить в присутствии соответствующего контроля.

Практическое значение для идентификации вирусов в растении имеют следующие модификации:

капельный метод. На предметном стекле каплю антисыворотки смешивают с каплей сока растения и через несколько минут оценивают реакцию под микроскопом при малом увеличении в темном поле или визуально без микроскопа. При положительной реакции заметен хлопьевидный осадок

метод двойной диффузии в агаровом геле используют для определения сферических и других мелких вирусов. При этом в одни лунки, вырезанные в слое агара, в чашках Петри добавляют антисыворотку, а в другие – очищенный сок растения. Антитела и вирусные частицы диффундируют в геле навстречу друг другу и образуют в месте встречи отчетливые линии преципитации;

при использовании метода радиальной иммунодиффузии антисыворотку добавляют непосредственно в агар, а лунки заполняют соком. При положительной реакции вокруг лунок образуются преципитаты в форме колец;
метод адсорбции основан на том, что перед реакцией с антигеном антитела связывают каким-либо инертным материалом с крупными частицами, например латексом. При реакции с антигеном происходит хорошо заметная агглютинация всего комплекса;
наиболее высокочувствительной, позволяющей получить количественные оценки модификацией является иммуноферментный анализ (ИФА), основанный на связывании антител определенными метками – ферментами.
В лунки микроплаты из полимерных материалов добавляют антисыворотку и очищенный сок, содержащий вирусы – антигены; между ними происходит первая иммунная реакция. Затем на фиксированный комплекс антиген – антитело наносят раствор антител, связанных ферментом (фосфатаза или пероксидаза); при этом меченные ферментом антитела наслаиваются на детерминанты молекул антигена и начинается вторая иммунная реакция. После добавления соответствующего ферментного субстрата происходит ферментная реакция по каталитическому расщеплению субстрата, что обнаруживается с помощью фотометра по цветной реакции. Метод электронной микроскопии дает возможность быстро получить информацию о наличии вирусных частиц в растении. С помощью электронных микроскопов на ультратонких срезах пораженных частей растений можно установить форму, строение и даже размеры вирусов. Трансмиссионный электронный микроскоп используют для серийных анализов вирусной инфекции в соке растений. С помощью иммуно-электронной микроскопии можно обнаруживать вирусные частицы с наслоившимися антителами.

Метод гель-электрофореза основан на электрофоретическом разделении предварительно очищенных нуклеиновых кислот вируса (вироида) или его белкового компонента в полиакриламидном геле при силе тока 3 и 6 мА с последующим окрашиванием красителем зон соответственно нуклеиновых кислот или белков. При сравнении высоты полученных окрашенных линий с высотой стандартных, или маркерных, зон определяют массу (соответственно и размеры) вирусных структур. Молекулярно-генетические методы основаны на знании строения молекулы РНК вируса или вироида. Отличаются высокой надежностью, чувствительностью, быстротой. К недостаткам этих методов относятся высокая стоимость реактивов и оборудования для проведения диагностики, а также необходимость предварительного изучения генетических кодов патогенов. Наиболее распространенный тест – амплификация (умножение) видо-специфичных последовательностей РНК при полимеразной цепной реакции (ПЦР), в ходе которой отдельные химически синтезированные фрагменты РНК (праймеры), характерные только для одного вида или рода вирусов, участвуют в ферментативном воспроизведении соответствующих участков матричной РНК, выделенной из зараженного растения. Продукты ПЦР с помощью ферментов многократно клонируют (амплифицируют) при определенных режимах температур в циклическом термостате, при этом исходное число копий выбранного фрагмента РНК возрастает в миллионы раз. Затем их обнаруживают методом гель-электрофореза или иммуно-флуоресценции. Несмотря на сложность и дороговизну, ПЦР-диагностика – перспективный метод, в десятки раз более чувствительный, чем иммунохимические методы. Он позволяет выявлять и идентифицировать новые вирусы и их штаммы. Метод ДНК-зондов – другая модификация молекулярно-биологического метода, также основана на принципе комплементарности видоспецифичных последовательностей нуклеиновых кислот. Синтезируют зонды, которые «узнают» определенные нуклеотидные последовательности РНК вируса. В зависимости от выбора зондов можно дифференцировать роды, виды и штаммы вирусов.

К методу пересадки растений на другой участок прибегают для подтверждения или опровержения вирусной природы заболевания. Например, для определения причин хлороза растений их можно пересадить на заведомо благоприятную почву. Если заболевание неинфекционное, то через некоторое время у растений восстановится типичная зеленая окраска. При вирусном заболевании хлороз сохранится. Метод включений – один из самых простых методов, не требующих дорогостоящего оборудования. Развитие некоторых вирусов в клетках растения сопровождается образованием в них скопления вирусных частиц (включений, или кристаллов Ивановского), которые обнаруживаются с помощью обычного светового микроскопа. Каждому виду вируса свойственна своя форма вирусных включений, образующихся обычно в клетках волосков или эпидермиса листьев. Например, для вируса табачной мозаики характерны игловидные и гексагональные кристаллы; для Х-вируса картофеля и вируса мозаики пшеницы типично образование сферических аморфных тел. Для выявления зеленой крапчатой мозаики огурца, скручивания листьев картофеля и некоторых других болезней применяют химические аналитические методы диагностики в пораженных тканях растений.