Ўзбекистон республикаси соғЛИҚни сақлаш вазирлиги тошкент фармацевтика институти

t_R =t_R1 +t₀
Бундай шароитда колонкаларда моддаларининг бўлиниши қуйидагича чизма график холида ифодалаш мумкин.
t_м – қўзғалувчан фазани ушланиш вақти
t_R1, t_R2 – тоза ишланиш вақти
t_R1, t_R2 – моддаларни ушланиш вақти
W – пикнинг асосини кенглиги
δ -гаусс айланмани дисперсияси
Хосил бўлган хроматограмма моддаларни сифат кўрсаткичини аниқлаш учун фойдаланиладиган бўлса, у холда ушланиш вақти моддаларнинг концентрациясига боқлиқ бўлмайди. Ушланиш вақти асосан элюент тезлигига боғлиқ бўлганлиги учун бу усулда кўпроқ ушланиш хажмий қиймати билан фойдаланилади. Шунга асосан ушланиш хажми (V_R), моддани ушланиш вақтига (t_R) ва элюентнинг хажмий тезлигига (F) см³/мин тўғри пропорционал боғлиқдир.
V_R=t_R* F
Шунга асосан сорбцияланмаган модданинг ушланиш вақтини билган холда, колонкадаги харакатланувчи фазанинг хажмини (V_M) аниқлаш мумкин
V_M = t₀* F
Бундан тузатилган хажмий ушланиш (V_N) қийматини топиб олинади. Унинг қиймати (V_R) ушланиш хажмидан
V_N= V_R -V_M
Харакатланувчи фазанинг хажмининг айирмасига тенгдир. Тузатилган ушланиш хажми пропорционал холда қўз=алмас фазани хажмига (V_S) тенгдир.
V_N=К* V_S
 
Пропорционаллик коэффициенти (К) бўлинишдаги термодинамик коэффициентига тенг бўлиб, бўлиниш хроматографиясида у Нернст бўлиниш коэффициентига тўғри келади.
Усулнинг оптимал шароитини ва тахлил вақтини танлиш.
Дори моддаларини суюқлик хроматография усулида тахлилини олиб боришда қуйидагилар мақсадга мувофиқ:
1. Қисқа вақт оралиғижа энг асосий моддани ажралишга эришилиши
2. Усулда фойдаланилган техник камчиликлар энг кам бўлиши
Хар бир тажрибада дори моддасини тахлилини олиб боришда қўзғалмас ва қўзғалувчан фазалар ва ўзига хос хароратда энг яхши ва энг юқори нисбий ушланишга (α) эга бўлиши керак. Хар доим маълум хароратда ва энг яхши системалардан фойдаланиш натижасида кам теоритик тарелкалардан хамда қисқа колонкалардан фойдаланишга харакат қилиши керак. Ана шуларни инобатга олган холатларда қуйидаги тенглама асосида қулай пикларни олишга эришилди.
Lŋ
t_R=Н*N--------(1+k₂)
К.ΔР
t_R – умумий ушланиш вақти
N- теоритик ликопчалар сони,
Н-теоритик ликопчаларнинг баландлиги
L-колонка узунлиги, см
ŋ -элюат қовушқоқлиги
ΔР -босимни тушиши (дм/см²)=10^-6 атм.
К-термодинамик бўлиниш коэффициенти
К₂ – тақсимланиш қиймати
Формула асосида хар хил элюантлар ичидан қулай пикларни хосил бўлиши асосида энг кам қовушқоқликка эга бўлган қўзғалувчан фазани танлаб олишга эришилади. Колонкаларни фойдаланиш даражаси ва моддаларни ажралиши уларни сорбент билан қандай тўлдирилганига боғлиқдир. Юқорида айтиб қтилишича моддаларни яхши ажралиши учун қисқа узунликдаги колонкалардан фойдаланиши тавсия этилади. Бунда кичик узунликдаги колонкаларда, маълум меёрда теоритик ликобчаларни сақлашдан иборатдир.
Чунки теоритик ликобчалар, заррачаларнинг квадрат қийматига тескари пропорционалдир, қунинг учун хар доим кичик ўлчамли қўзғалмас фазанинг заррачаларидан фойдаланиш лозим. Аммо айрим холатларда қўзғалмас фазанинг заррачаларини қанчалик кичиклаштирилса у холатда элюантни колонка орқали ўтиши шунчали қийинлашади, шунинг учун бу холатларда ички босимни оширишни талаб этилади. Оддий босим берувчи мосламалар 300-400 атм., босимни беришга қодирдир. Буларга асосланиб хар бир холатни инобатга олиб иш тутишни тавсия этилади.
Юқори самарали хроматография усулини олиб боришда фойдаланиладиган колонкаларга қуйидаги талаблар қуйилади:
1. моддаларни ажратиш даражаси
2. тахлилни олиб бориш тезлиги
3. колонкани ишлатиш даражаси.
Тахлилни олиб боришда яхши натижаларга эришиш учун асосан серғовак сиртли сорбентлардан фойдаланишини тавсия этилади. Шу билан бир қаторда текширилаётган модданинг концентрацияси кичик миқдорда ва тахлилни узоқроқ олиб боришни тавсия этилади. Бунда системадаги босимни ошириш хам мақсадга мувофиқдир. Қўзғалувчан система учун бир-қанча эритувчилар берилган бўлса, у холда улардан кам қовушқоқликка эга бқлган эритувчиларни танлишни таклиф этилади. Шунинг учун ликопчаларнинг сонини ва элюатни бир меёрдаги тезликда олиб боришда эритувчини қовушқоқлигини камайтирилиши ёрдамида эришилади.
Усулни олиб боришда фойдаланиладиган усуллар:
Юқори самарали хроматографик усуони олиб боришда қуйидаги расмда келтирилган қурилмалардан фойдаланилади.
1 - суюқлик жойлаштириадиган мослама
2 - доимий суюқлик билан таъминловчи насос
3 – эхтиёткорлик жўмраги
4 – насосни ишини бир меёрда таъминлашга ёрдам берувчи мослама
5 – босимни ўлчовчи (монометр)
6 – текширилувчи моддани колонкага юбориладиган мослама (дозатор)
7 – колонка
8 – детектор
9 – ёзиб олувчи, диограмм лентали қурилма
10 – фракцияларни йиғиб оладиган коллектор
11 – термостат
Аппаратни бир меёрда ишлаши учун эритувчи солинадиган мослама 1000 мл хажмида бўлишини талаб этилади. Кўп холатларда бу мослама суюқлик таркибидаги газларни йўқотиш асбоблари билан узвий боғлиқликда уланган бўлади.
Суюқликни колонкага туширишда насоснинг ахамияти каттадир. Бунда суюқлик тезлиги 10 мл-мин, хамда 300-400 атм. Босим оралиғидаги жараёнда харакатланади. Аниқланувчи моддани колонкага юборишда дозатор орқали юборилади. Дозаторга эритма холида текширилувчи моддадан фойдаланилади. Колонкалар асосан зангланмайдиган пўлат, хамда шиша ва титан найчалардан тайёрланади. Шиша колонкалардан фойдаланишда ташқаридан кузатишга имконият бўлади. Лекин ички босимни 70 атм. Дан юқорига кўтариш мақсадга мувофиқ эмас. Колонкалар термостат хажмига боғлиқ бўлиб асосан ички диаметри 2-4 мм, узунлги 10-50 см ни ташкил этади.
Колонкадан ўтаётган суюқ эритувчини харакатини доимий равишда детектор орқали текшириб берилади.
Детекторлар икки гурухга ўзига хос гурух моддаларни хусусиятини, хамда универсал хусусиятни намоён этадиган ўзига хос гурух моддаларини аниқлашда флюоресценциялар ва бошқа электрокимёвий усуллар ёрдамида амалга оширилади. Унга асосан дори воситаларининг кам миқдорини биологик суюқликлар таркибидан аниқлашда чиқинди моддаларни ва бошқаларни аниқлашда фойдаланилади. Универсал детекторлар ёрдамида модданинг хусусияти бор ёки йўқлигидан қатий назар суюқликдан чиқаётган хар қандай моддани хусусиятини аниқлашга қодирдир. Бу усул хозирги кунда нефт кимёси, озиқ-овқат саноати ва фармация ишлаб чиқариш саноатларида кенг фойдаланиб келмоқда.
Детекторларга қўйилган талаблар:
а) юқори сезгирликка эга
б) текширилаётган модда детектор орқали ўтаётганда парчаланиши
в) хароратни ўзгариши, суюқликнинг оқим тезлиги, хамда қўлланилаётган эритувчининг таркиби детекторнинг ишлаш жараёнига таъсир кўрсатмаслиги лозим.
г) детектор текширилувчи моддани сифатини ва миқдорини аниқлашда асосий кўрсатгичи бера олиши лозим.
Бу хроматографик тахлил усулида ўзига хос детекторлар (УБ детектори ёки дефферинциал рефрактометр) қўлланилади. УБ детектори ва дефферинциал рефрактометрлар хозирги юқори самарали хроматографларда кўпроқ қўлланилади. УБ детекторлар УБ тўлқин узунлигида ютилиши кўпгина дори моддаларини аниқлашда сезгирдир. Шунинг учун фойдаланиладиган эритувчи ўта тоза ва тиниқ бўлиши талаб этилади.
Дифференциал рефрактометрлар харорат ва босимга жуда сезгирдир. Иккала детектор орқали эритмадаги моддани концентрациясини аниқлашда фойдаланилади.
Детекторларга қуйидаги талаблар қўйилади:
а)Юқори сезгирликка эга бўлиши
б)Текширилаётган модда детектор орқали ўтаётганда парчаланмаслиги
в) Хароратни ўзгариши, суюқликнинг оқим тезлиги, хамда қўлланилаётган эритувчининг таркиби, детекторнинг ишлаш жараёнига таъсир кўрсатмаслиги лозим.
г) Детоктор текширилувчи моддани сифатини ва миқдорини аниқлашда асосий кўрсаткични бера олишни лозим.
УБ детекторнинг камчилиги фақатгина айрим малекулаларни нур ютилиш хусусиятини аниқлашга мўлжалланган бўлиб детекторни қайси оралиқда нур ютилиш оралиғига тўғри келса ёки шунга яқин оралиқда бўлиши билан боғлиқдир. Детекторнинг ўта кучли сезгирлигига асосан модани энг юқори нур ютиш тўлқин узунлигида олиб борилмаса хам бўлади. Детекторни УБ нурни симобли лампа иштирокида   254 нм тўлқин узунлигида ароматик бирикмалар, кўпчилик кетонлар, альдегидларни аниқлашга эришиш мумкин. Айрим холатларда УБ нурни фосфорли экран иштирокида 280 нм тўлқин узунлигида тахлил олиб бориши мумкин.
ЮССХ ускуналарида рефрактометрли детекторлардан ҳам фойдаланилади. Унда ҳам элюант орқали чиқаётган модданинг хусусиятини аниқлашга эришилади. Бу турдаги детекторла ўзининг универсаллиги билан иккинчи (УБ детектордан) сўнг ахамиятлидир. Шу билан бир қаторда бу детектор ёрдамида хар қандай эритувчи ёрдамида ўта тозаликни талаб этмайдиган
ҳамда 150С гача жараёнда амалга ошириш мумкин. Бу эса айниқса синтетик полимерларни тахлилда қўллашга ахамиятлидир.
Юқори самарали хроматография усулини олиб боришда қўзғалувчи фазага катта талаб қўйилган. Чунки улардан фойдаланиш даврида таркибидаги чиқиндилар колонкани ифлослаш торози, хамда нотўғри ишларни хосил бўлишга сабаб бўлади.
Қуйидаги жадвалда юқори самарали хроматография усулини олиб боришида ўтказувчанлик хусусиятига асосланиб кенг фойдаланиладиган эритувчилар келтирилган.
1. Тозаланган сув
2. Спирт
3. Алканлар
4. Ацетонинитрил 
5. Циклогексан
6. Оддий эфир
(перекс колдикларидан холи
бўлиши керак )
7. Тетрагидрофуран
8. Алкилгалогонидлар
9. Метил хлорид
10. Хлороформ
11. Сирка эфир спирти
12. Углирод(VI) хлорид
13. Ароматик угливодлар
14. Ацетон
Жадвалдаги келтирилган эритувчилар ичида энг яхши ўтказувчанлик хусусиятига тозаланган сув эгадир. Шунинг учун фақат “спектроскопия” учун фойдаланиш кўрсаткичи берилган бўлиши керак, акс холда аввал тозалаб сўнгра фойдаланишни талаб этилади.
Шунинг учун ЮССХ ускуналарда рефректометрли детекторлардан хам фойдаланилади. Унда хам элюант орқали чикаётган модданинг хусусиятларини аниклашга эришилади. Бу турдаги детекторлар ўзининг универсаллиги билан 2 чи (УБ детектордан) сўнг ахамиятлидир. Шу билан бир катордав бу детектор ёрдамида хар кандай эритувчи ёрдамида ўта тозаликни талаб этмайдиган хамда 150⁰С гача жараёнда амалга ошириш мумкин. Бу эса айникса синтетик полимерларни тахлилида кўллашга ахамиятлидир.
Юқори самарали суюқлик хроматографик усулни амалга оширишда қўлланиладиган эритувчилар системасига қуйидаги талаблар қўйилади:
1) хроматографик ажратиш хароратида моддани тўлиқ эрита олиши;
2) қўлланиладиган калонкани активлик хусусиятига таъсир этмаслик;
3) қўзғалмас фазанинг адсорбция жараёнига таъсир этмаслик;
4) қўлланилаётган детекторнинг сезгирлигини ошириб беришда юқори хусусиятга эга бўлиши
5) Кам қовушқоқлик ва захарсиз бўлиши керак
Олиб борилган тахлил натижаларининг аниқлигига айниқса эритувчининг турғунлги ва уни хроматографик колонкага етказиб бериш тезлигига катта боғлиқдир. Хозирги қўлланилаётган хроматографик усуллардаги насослар ёрдамида хар доим бир хил натижа олишга шароит яратиб бера олмаслиги мумкин. Оддий жараёнда 1мл/мин эритувчини насос ёрдамида таъминотида 0,01мл/мин ташкил этса, бу ўз холатида аниқланувчи модданинг молекуляр оғирлигига нисбатан 10% хатоликка олиб келиши мумкин. Шунинг учун бу холатни бартараф этиш учун хар куни хроматографик жараённи амалга ошириш даврида насос орқали берилаётган эритувчининг тезлигини текшириб туриш лозим.
Колонкаларнинг юқори самарадорлигини сақлаш мақсадида 10 мкм ўлчамга эга бўлган сорбентлар учун эритувчининг оқими ўртача 1 мл/мин тўғри келиши керак. Агарда эритувчининг оқим тезлиги кўпайтирилса колонканинг ТТБ қиймати катталашади натижада айниқса юқори молекуляр оғирликдаги ажратишда аниқлик даражаси пасаяди. Масалан синтетик полимердан полистеролни М39*10⁴ г моддани қаттиқ сорбентли колонкадан эритувчини оқим тезлигини 1 мл/мин дан 2 мл/мин гача оширилса колонкани самарадорлиги 1,5 маротаба камайишига олиб келади.
Юқори самарали суюқлик хроматографик усулни олиб боришда харорат маълум даражада бўлишини талаб этилади. Асосан жараён 20-25С хароратда олиб борилади, лекин хусусиятига қараб айниқса полимерларни тахлилида 135-150С хароратли термостат ёрдамида амалга оширилади. Хароратни кўтариш айрим эритувчиларнинг қовушқоқлик хусусиятини камайтириш, бу билан колонканинг самарадорлигини оширилади. Шунинг учун хона ҳароратига нисбатан хароратни 40-50С жараёнида олиб бориш мақсадга мувофқдир.
Колонкага юбориладиган таҳлил қилинадиган модданинг миқдори ҳам аҳамиятига эгадир. Асосан 1 г сорбент сақлаган колонкага полимер моддаларидан 0,1-0,5 мг миқдорда талаб этилади.
Хозирги кунда кенг қўлланиладиган колонка диаметри 7-8 мм, узунлиги 50-60 см колонкаларга 3-5 мг аниқланувчи моддани юбориш мақсадга мувофиқдир, акс холда катта миқдорда қўллаш натижасида колонкада моддаларни ушланиш хажми ортиши, колонкани самарадорлик хусусиятини камайишига сабаб бўлади.
Юборилаётган эритувчининг хажми, ҳам маълум миқдор мувофиқ эмас. Асосан колонкага юбориладиган модданинг хажми 25-300 мкл оралиғида бўлиши керак. Акс холда хажмини кўпайиши ҳосил бўладиган пкларни ноаниқликларига олиб келади.
Шунинг учун изланиш олиб борилаётган модданинг хусусиятини инобатга олган холда оғирлигига, эритманинг концентрациясига, колонкага юборилаётган эритувчининг хажмига ва бошқа кўрсаткичларини итоат қилган ҳолда аниқ натижаларга эришилади.
Дифференциал рефрактометр ёрдамида умумий, яъни текширилувчи модда ва элюатни нур ютиш хусусиятини аниқлашга эришилади. Шунинг учун модданинг сигналини, эритувчининг сигналидан фарқлаш мақсадида дифференциал детекторлардан фойдаланилади. Дифференциал детекторларни камчилиги детектор сезгирлиги хароратни ўзгаришга боғлқдир. Агарда 1С харорат ўзгарса детекторнинг кўрсатиши 10^-4 қийматига ўзгаради. Шунинг учун детектордаги хароратни + қийматга ўзгаради. Шунинг учун детектордаги хароратни +0,001С аниқлик билан олиб боришини талаб этилади.