Islom karimov nomidagi toshkent davlat texnika univyersiteti

12-Ma’ruza

Mavzu: Temir va oltingugurt oksidlovchi atsidofil bakteriyalar assotsiyaatsiyasining oqsil buyicha biomassasini aniqlash
Reja

1. Pulpa tarkibi

2.Mikroorganizmlarning miqdorini aniqlash usullari

3.Xujayralarni ranglangan va fiksatsiya qilingan buyanmalarda sanash (Vinogradskiy – Brid usuli)
Pulpa. Ishqorlanadigan minerallarning kimyoviy tuzilishidan kelib chiqib modifikatsiya qilingan Peterson usuli qo’llaniladi [9-11]. Analiz quyidagi etaplardan tashkil topgan:

1.Pulpadan xujayralar Eritmasini (gidrolizatni) ajratib olish.

2.Uch xlor uksuskislotasi (UXU) va natriy dezoksixinolyati yordamida oqsil chuktiriladi.

3.Olingan chukmadan (gidrolizatdan) oqsilining miqdorini aniqlash.

Pulpa yaxshi qorishtirilib, undan 5 ml olinadi va suvlik hammomda 15 minut 25 ml NaOH ishtirokida har zamonda qorishtirib turiladi va qaynatiladi. Bunda Eritmada va minerallar bulakchalaridagi adsorbsiya bulgan barcha xujayralar gidrolizlanadi (Eriydi. Xujayralar gidrolizi tulaligini ushbu jarayonni qayta takrorlash usuli bilan tekshirib, keyin oqsil aniqlanishiga utiladi.

Gidrolizatni (Eritmani) qattiq fazadan ajratib olish uchun 5 minut davomida 5000 ob/min davomida sentrifugalanadi. Sentrifugalangan gidrolizat rangsiz va tiniq bulishi kerak. Agarda ushbu shart bajarilmasa, oqsil miqdori buyicha kursatkichlar baland bulishi mumkin. Rang paydo bulishi, destruksiyaga uchragan sulfid minerallaridan gidrolizatga metall ionlari va sulfid oltingugurti chiqqanidan dalolat bo’ladi.

Olingan gidrolizatlar rangi sarg‘imtir bulgani uchun, ularni vodorod perekisi bilan (1 tomchi H₂O₂ 1 ml gidrolizatga) ishlov berib 3 minut davomida xona temperaturasida ushlab turiladi.

Bunday ishlovdan sung sulfidlar sulfatlar holatiga utishadi. Vodorod perekisiningziyod miqdorini qaynagan suv hammomida qizdirish bilan olinadi. Vodorod perekisining tuliq olinganini ammoniy rodanidi bilan nazorat qilinadi.

Keyingi etap gidrolizatdan oqsilni chuktirib olishdan iborat. Buning uchun 3 ml gidrolizatga 0,9 ml 0,15% foizli natriy dezoksixinolyati qushilib, 10 minut davomida xona temperaturasida ushlab turilib, keyin 0,9 ml 72% foizli UXU kislotasi qushiladi va sentrifugalanadi, keyin chukma filtrli qog‘ozlarga probirkalardan tuntarilib quritiladi. Modifikatsiya qilingan Louri usuli buyicha oqsil chukmasi bilan kolorimetrik reaksiya olib boriladi. Buning uchun chukmaga 1 ml suv va 1 ml A Eritmasi (Eritma tarkibi: A Eritmasi tarkibi 0,8 M NaOH, 10% natriy dodetsilsulfati, suv, va 10% foizli natriy karbonati, 0,2% foizli vinnokisliy kaliy va ).1 mis sulfatining qorishmalaridan tarkib topgan barobar xajmlaridan iborat) qushiladi. Reaksion qorishma yaxshilab qorishtiriladi va 10 minut davomida xona temperaturasida ushlab turiladi. Bundan keyin unga 0,5 ml Folin Eritmasi quyiladi ( Folin reaktivi quyidagicha tayyorlanadi: 100 g natriy volframovokisliyga, 25 g natriy molibdenovokisliy, 750 ml suv, 85% foizli 8 ml fosfor (orto) kislotasi va 100 ml suv) bilan 10 soat davomida ugirilgan muzlatgichda sekin qaynatiladi. Keyin 150 g litiy sulfati, 50 ml H₂0 va bir nechta tomchi brom qushiladi. Bromning ziyod miqdori muzlatgichsiz qaynatish usuli bilan olinadi, sovutiladi, filtrlanadi, va xajmi 1 l etkaziladi, 10 barobar suyultiriladi, qorishtiriladi, 30 minut xona temperaturasida ushlab turilib, 750 nm tulqin Uzunligida optik zichligi ulchanadi. Uskunaning nol holatiga quyish uchun nazorat Eritmasi yordamida tekshiriladi. Nazorat Eritmasi boshlang‘ich konsentratdan 1 ml ishqoriy gidrolizat olinib reaksiyaning barcha komponentlari qushiladi.

Kalibrlovchi qiyshiq chiziqni xukiz albumini standart Eritmasi yordamida tuzildi. Oqsilning aniq miqdorli namunalariga 5 ml 0,5 N NaOH qushib, undan 1 ml qorishma ajratib olinib, yuqorida kursatilganidek, oqsil chuktirishi va aniqlashi olib boriladi. Qiyshiq chiziq tuzilishi usulning barcha suyultirishlari va ayrim kamchiliklarini aniqlashga yordam bYeradi.

Tahlilning tug‘riligiga Eritmadagi metall ionlari ta’sir etishi mumkin, masalan misning. Analizning hatolarini aniqlash uchun 1 ml xajmdagi albumin qushilgan stanadart probalariga sentrifugalash usuli bilan bakteriyalari ajratib olingan 1 ml suyuq fazadagi pulpa qushiladi. Ularga 4 ml 0,5 NaOH qushib, keyin 1 ml proba tahliluchun olinadi. Oqsilni chuktirish va uning kolorimetrik aniqlanishini yuqorida kursatilgan usul bilan olib boriladi. Olingan ma’lumotlarni oqsilning standart Eritmalari bilan solishtiriladi. Oqsilning miqdori va oxirgi Eritmaning optik zichligi orasida tug‘ri proporsional mutanosiblik farqi pulpada 0,3 dan 2,0 mg/oqsil orasida bulishi mumkin.

Ushbu usul tekshirilgan va tarkibida mis metalli yuq bulgan sulfid konsentratlarning ishqorlanishida qo’llaniladi.

Mikroorganizmlarning miqdorini aniqlash usullari

Mikrobiologik amaliyotda mikroorganizmlarning usishini, hoh tabiiy substratlar bulsin, hoh ozuqaviy muhitlar bulsin, xujayralarning miqdorining va biomassasining O’zgarishini bir xil xajmda ulchanadi. Ushbu kursatkichlarning ulchash usullari tug‘ri (mikroskop ostida xujayralarni sanash, ulchash) va bilvositabulishi mumkin. Bilvosita usullar xar xil nazorat kursatkichlarning ulchamlarida asoslangan bo’lib, ularning ulchami mikroorganizmlarning miqdori va biomassasi bilan bog‘liq buladi (suspenziyadan ozuqaviy muhitga ekilgandan keyin usgan koloniyalar soni, supenziyadan nupHing tarqalishi va yutilishi, undagi oqsilning miqdori va h.). Usulni tanlash, tadqiqotning maqsadidan, ozuqaviy muhitning va substratning hususiyatlaridan va mikroorganizmlarning morfologiyasi va o’sish xilidan kelib chiqadi.
Xujayralarni ranglangan va fiksatsiya qilingan buyanmalarda (mazkax) sanash (Vinogradskiy – Brid usuli)

Ushbu usul mikroorganizmlarning sonini aniqlash uchun xar xil modifikatsiyalarda tabiiy substratlar–tuproq, ifloslangan suv, optik ko’rinmaydigan, tarkibida erimaydigan komponentlar bor muhitlarda, masalan kraxmal, soya uni va b. qo’llaniladi. Usulning ustun tomonlari shundan iboratki, fiksatsiya qilinib ranglangan preparatlar Uzoq davr saqlanishi mumkin va ularni tadqiqotchining qulay vaqti bulganda sanashi mumkin.

Preparatni tayyorlash

Yaxshilab yog‘sizlantirilgan mikroskopning predmetoynasini millimetrli qog‘ozga quyiladi va unda maydoni 4 yoki 6 sm² li turt burchak chiziladi. Keyin oynaga tadqiq etilayotgan suspenziya xajmi tomiziladi (10; 20 yoki 30 mkl), ayrim hollarda 0,03-0,1%-foizli suvli agar Eritmasi tomchisi ham tomiziladi. Tomizilgan suspenziyani simli bug‘incha (petlya) bilan millimetrli qog‘ozga chizilgan maydonga tekis qilib surtiladi. Preparat havoda quritiladi, 10-20 minut davomida 96° foizli absolyut etil spirti bilan fiksatsiya qilinadi va Eritrozin bilan ranglanadi, yoki metilen kuki, fuksin va boshqa buyoq bilan. Keyin preparat yuviladi, navbati bilan 4-5 shisha idishdagi suvga botirib (oqar suvda yuvish mumkin emas) va havoda quritiladi. Bunday holda preparatlar yaxshi saqlanadi.

Sanash qoidalari. Preparatni mikroskop ostida immersion ob’ektiv yordamida kuriladi. Bunda okulyar setkasining kvadrat maydonchalar ichidagi xujayralar soni hisobga olinadi. Okulyar turchani kuz va yig‘uvchi linzalar orasiga joylashtiriladi. Turcha bulmagan holda xujayralar sonini mikroskop kurish maydonida hisoblanadi. Okulyar turdagi va hisoblash kamerasidagi kvadratchalardagi hisoblash qoidalari bir hil. Natija tug‘ri chiqishi uchun 50-100 kurish maydonidagi mikroorganizmlar xujayralari miqdori hisoblanadi. Umumiy hisobga olingan xujayralar soni 600 tadan kam bulmasligi kerak. 1 ml tadqiq etilayotgan substratdagi mikroorganizmlar xujayralari quyidagi formula orqali aniqlanadi

M = (aS/sV)n,

bunda M - 1 ml substratda tadqiq etiladigan xujayralar miqdori; a – okulyar turdagi bir kvadratning (kurish maydoni) urtacha xujayralar miqdori); s – okulyar turidagi kvadratning maydoni (kurish maydoni), mm; V — oynaga tomizilgan suspenziya xajmi, ml; S — surtilgan suspenziya maydoni, mm²; p —urganiladigan substratning suyultirish koeffitsienti.

Tur kvadratining maydoni, yoki kurish maydoni, ob’ekt-mikrometr yordamida aniqlanadi. Uni mikroskop stolchasiga preparat upHiga quyib, xujayralar miqdori hisoblangan kattalashtirish foizi saqlangan holda, okulyar turning kvadratining bir tomoni aniqlanadi, yoki kurish maydoni diametri ulchanadi. Ko’rish maydonining xajmi quyidagi formula bilan aniqlanadi S = yag².

2.7. Xujayralarni suyuq muhitlarga ekib hisoblash (cheklangan suyultirish usuli )

Ushbu usul qattiq ozuqa muhitlarida usmaydigan, yoki yomon usadigan mikroorganizmlarning miqdorini hisoblash uchun ishlatiladi. Bir xil xajmda aniq ulchangan suyuq muhit solingan probirkalarga xar xil qilib suyultirilgan suspenziya quyiladi. Inkubatsiya jarayonidan keyin, xujayralar ko’paygan yoki ko’paymagan probirkalarning sonidan kelib chiqib, 1 ml substratdagi mikroorganizmlarning kutilgan miqdori aniqlanadi.

Cheklangan suyultirish usulining mazmuni shundan iboratki, unga suyultirishga tayyorgarlik, suyuq muhitga ekish, inkubatsiya jarayonidan keyin xujayralarning ko’paygan yoki ko’paymaganini hisoblab va ruyxatga olib, belgilangan xajmdagi mikroorganizmlarning kutilgan miqdori aniqlanadi.

1. Suyultirilgan suspenziyani tayyorlash. Birmlamchi suspenziyani Petri chashkalaridagidek usul bilan tayyorlanadi.

2. Ekish va natijalarni qayd etish. Steril muhitni oldin probirkalarga quyib (kolbalar) yana sterilizatsiya qilinadi. Probirkalarga (kolbalarga) bir xil miqdordagi muhit solinadi. Ekishni oldingi suyultirilgan probirkalardan olinadi, yoki oxirgi 4 va 5 chidan va xar bir suyultirilgan variant 3-5 marotaba takrorlanadi(parallel probirkalarda). Ekilgan materialning miqdori hamma probirkalarda bir xil bulishi kerak va 1 ml tashkil etishi kerak. Ekilgan probirkalarga variant va probirka raqami yozilib, shtativga quyilib, termostatga joylanadi. Inkubatsiya davri 2 dan 15 sutkagacha davom etadi va mikroorganizmlarning usish tezligiga bog‘liq. Inkubatsiyadan keyin mikroorganizmlarning usish natijalari olinadi va bunda xar xil kursatkichlar qayd etiladi: muhitning loyqalanishi, plenka paydo bulishi, gaz yoki muhitda ma’lum miqdorda paydo bulgan metabolizm maxsulotlari.

Mikroorganizmlarning ko’payishini, ma’lum xajmdagi muhitning O’zgarishidan qayd etilib Mak-Kredi jadvalidan hisoblanadi (jadval 2.7.1.). Ushbu jadval variatsion statistika usullari asosida ishlangan. Buni amalga oshirish uchun, avvalambor raqamlardan iborat ma’lumotnoma tayyorlanadi va unga uchta raqam kiritiladi. Chapdan birinchi raqam probirkalarning oxirgi suyultirishdagi mikroorganizmlar ko’paygan sonini kursatadi. Qolgan ikkita raqam nechta probirkalarda mikroorganizmlar usganini qayd etadi. Keyin jadvaldan izlab ushbu raqamlar quyilib, mikroorganizmlarning taxminiy miqdorini qayd etadigan raqamli ma’lumot olinadi. Mikroorganizmlarning taxminiy miqdori 1 ml (1g) birlamchi substratdagi soni va uni birinchi uchtalikdan olingan raqamga ko’paytiriladi.