Virusologiya fanidan laboratoriya mashg`ulotlari ishlanmasi

13-labarotoriya mashg’uloti. Mavzu: Pretsipitatsiyaga asoslangan diagnostika ishlash printsipini o’rganish

14-labarotoriya mashg’uloti. Mavzu:Immunodiffuziyaga asoslangan va ularning viruslarni aniqlashda qo’llanilishini o’rganish.

15-labarotoriya mashg’uloti.Mavzu:Immunoferment analizi usuli va uning viruslar diagnostikasida qo’llanilishini o’rganish.
Ishdan maqsad. IFA ni o`rganish va bu usul yordamida boshqa usullar sezgirligi yetmagan xollarda va hujayrada juda kam to`planadigan viruslarni har xil namunalarida aniqlashni o`rganish.
Kerakli materiallar: immun A3, peroksidaza yoki boshka fer­ment, natriy peryodat, K<sub>2</sub>SO4, sefadeks G -200, triton - X -100, substrat (N20<sub>2</sub> va aminosalitsil kislotasi), control zardob, virus namunalari, PEG (molekula massasi 6000) polistirol mikroplatlar (SHvetsariya firmasi chiqaradi) yoki poliamid membrana, termostat, xromatografiya kolonkasi, fraktsiya yiruvchi kollektor, FEK, spektrofotometr SF -26, titrator -107.
Ishning borishi. IFA viruslarni aniqlash quyidagi boskichlarda olib boriladi: 1. IFA olib boriladigan po­listirol platalar (yoki poliamid membranalari) ga AT lar ni immobilizatsiya kilish; 2. AT va fermentdan sintezlan gan konyugatperoksidaza va AT; 3. IFA ni amalga oshirish.
Avvalo polistirol plataga yoki poliamid membranaga immobilizatsiya kilinadigan AT ni A3 dan toza xolda aj ratib olish yoki gammaglobulin qismini ajratib olish uchun tozalangan virus yoki tekshiradigan virusli namuna mikroilat chuqurchalariga solinadi va bir soat davomida 37°S da sorbtsiya qilinadi .Keyingi yillarda nishon sifatida biokatalizatorlar fermentlar ishlatilmoqda. Bu xolda ferment o`tkazadigan reaktsiya immun reaktsiyani o`ziga xos "molekulali kuchaytirgichi" bo`lib xizmat qiladi. Immunoferment usuli mikroorganizmlarni, viruslarni va boshqa tur moddalarni aniqlashda maxsus o`rin egallaydi va immunologiya usullari orasida fitoviruslarni aniqlaydigan eng sezgir usul xisoblanadi.
1976 yilda Adam va Klark o`simlik viruslarini aniqlashda birinchi marta IFA ni qo`lladi. Bu usulning moxiyati shundan iboratki, ferment yoki koferment o`tadigan kimyoviy reaktsiyani tezlashtiradi.
Hozirgi vaqtda ishlatiladigan IFA 4 printsipiga asoslangandir: titrlash, konkurentsiya, ekranlanish va "sen­dvich"-variant. Bu printsiplardan o`simlik viruslari aniklash amaliyotida eng ko`p qo`llaniladigani " sendvich"-variantdir. Bu printsipni qo`llab virus aniqlash quyidagicha amalga oshiriladi. Polistirol platalarga (Polistiroldan yasalgan AT larni immobilizatsiyalanadigan chuqurchalar majmuasi) aniqlanadigan virusning immunoglobulinlari immobilizatsiya qilinadi ortiqcha AT lar yuvib tashlanadi. Uning ustiga aniqlanadigan virus namunasi qo`yiladi, ma`lum vaqt inkubatsiya qilingandan so`ng yopish -magan ortiqcha virus immunoglobulinlari immobilizatsiya qilinadi, sungra ortiqcha AT lar yuvib tashlanadi va so`ngra aniklanadigan virus namunasi qo`yiladi, malum vaqt in­kubatsiya qilingandan so`ng yopishmagan ortiqcha virus yuvib tashlanadi. Songra ferment bilan nishonlangan konyugat qo`yiladi. Malum muddatdan keyin yani inkubatsiya qilingandan so`ng konyugatning xam ortiqchasi yuvib tash lanadi va nishon sifatida fermentga xos substrat solinadi. Substratni ferment tomonidan parchalanganda xosil bulgan modda rangli buladigan bulsa platalarda yorqin rang xosil buladi. Rangning kup yoki kamligi virusning borli gini yoki kamligini yoki yo`qligini ko`rsatadi. Ferment substrat juftini moslab, u yoki bu substratni ishlatib xosil bulgan moddalarning rangi, elektr utkazuvchanligi,uning o`zgarishi, birorta moddani xosil bulishi yoki yo`qolishiga qarab ishlatiladigan IFA usulining aniklagich shartlarini tuzish va ularni avtomatlashgan xolda aniklashga utkazish mumkin. Ba`zi vaktda mikroplatalarga immunoglobulinlar yopishtirilib o`tirmasdan, to`g`ridan — to`gri aniklanadigan virus (AG) yopishtiriladi va qolgan aniklash yullari yuqorida ko`rsatilgandek olib boriladi Bu usul eng sezgir usuldir. Virus (AG) borligini boshka usullar bilan aniklab bulmagan vaziyatlarda bu usul qo`l keladi, ya`ni u bilan nanogramm mikdordagi viruslar (AG) larni aniklasa buladi. Bu usulni qo`llaganda AT va AG, AT bilan konhyugat (ferment va AT kompleksi), ferment bilan substrat orasidagi reaktsiyalar birorta kaggik fazada (polistirolda yoki poliamid membranada) olib boriladi.