Тиббий биология ва генетика Тиббиёт олийгохи талабалари учун дарслик

ГЕНЕТИК ИНЖЕНЕРИЙ
Генетик инженерия - молекулар, генетик, биокимёвий усулларни қўллаб, максадда кўзланган ирсий хусусиятга эга бўлган генетик тузилишларни, яъни ДНК молекуласини, хужайрани ёки организмни хосил қилиш. Генетик инженерия бўйича илмий ишлар 1930-йиллари ўтказила бошланган эди. 1934-йили Н.П. Дубинин дрозофила пашшасини нурлантириб ундан 3 жуфт ва 5 жуфт хромосомаси бўлган пашшаларни олди. Дрозофилада нормада 4 жуфт хромосома бўлади. Хозирги пайтда кўзланган мақсадга кўра генетик инженерия муаммоларини қуйидаги босқичларда ўрганиш мумкин: ген, хужайра, организм ва популатсия.
Ген инженерияси. Ген инженерияси ёрдамида нуклеотидлар тартиби ўзгарган ДНК молекуласи хосил қилинади ва уни ишлаб турган хужайра геномига ўтказилади хамда шу билан янги ирсий белгили хужайралар олинади. Ген инженерияси хозирги кунда организмлар ирсиятини ўзгартиришнинг энг қулай усулларидан бири бўлиб қолди. Америкалик олимлар К. Меррил, М. Гайер ва Дж. Петричелилар 1971-йили ичак бактерияси хромосомасидан ламбда бактериофаги ёрдамида сунъий ўстирилаётган одам хужайрасига галактоза-6 фосфатуридил - трансфераза ферментининг хосил бўлишини бошқариб турувчи генни кўчириб ўтказдилар. Маълумки, бу фермент одамда етишмаса галактоземия ирсийкасаллигипайдобўлади. Тажриба сунъий ўстирилган одам хужайрасида ўтказилган бўлса-да, молекулар ирсий касалликларни даволашда мухим ахамиятга эга. Ген инженерияси қуйидаги асосий масалаларнинг қандай ечилишига боғлиқ бўлди: 1) хар хил организмдан олинган ДНК молекуласини майда бўлакларга (генларга) ажратиш; 2) генлар ичидан кераклисини топиб, шу генни ташиб юрувчига (векторга) бирлаштириш; 3) ДНК сида керакли ген бўлган векторни хужайрага киргизиш; 4) кўпгина хужайралар орасидан кўчириб ўтказилган генни олган ретсипиент хужайраларни ажратиш. Биринчи масала эндонуклеоза, трансфераза ва лигаза ферментлари топилгандан кейин хал этилди. Иккинчи масалани ечишда вектор сифатида плазмидалар ДНК сидан фойдаланилди. Учинчи масалани ечишда калций тузлардан фойдаланилди. Калций тузлари таъсирида векторни қабул қилувчи хужайралар мембранасининг ўтказувчанлиги ошар экан. Шунинг учун керакли гени бор вектор осонгина хужайрага киради.Тўртинчиси эса генетик ва биокимёвий усуллардан фойдаланиб, керакли гени бўлган хужайраларни (клон) ажратиб олиш билан хал этилди.
Ген инженерияси одатда учта боскичда олиб борилади:
1. Керакли генни ажратиш ёки уни синтез қилиш.
Шу керакли гени бўлган ДНК ни кўчирувчи (вектор) ДНК сига улаш.Керакли ген уланган вектор ДНК сини хужайрага ёки организмга ўтказиш.

Кўзланган максадга кўра керакли генни хужайрадан ажратиб олиш ёки уни сунъий синтез қилиш мумкин.

Биринчи бўлиб,1969-йилда америкалик олимлар Шапаро ва Баквит ичак бактериясидан лактаза генини ажратиб олдилар. Бу генни ажратишда ламбда бактериофагидан фойдаланилди. Ламбда бактериофаги ичак бактериясидан лактаза генини ўзига бирлаштириб олади. Шундан кейин лактаза гени бўлган ушбу бактериофагдан махсус ферментлар ёрдамида тоза холда лактаза генини ажратиб олдилар ва уни кўчирувчига (векторга) бирлаштирдилар. Нуклеин кислоталарнинг хусусиятларини билиш, уларни сунъий синтез килиш мумкинлигини кўрсатди. А.Коренберг ва М. Джулианбиринчи бўлиб, сунъий генни синтез қилдилар. Сунъий генни хосил қилишида узилган ДНК бўлакларни
бирлаштирувчи махсус фермент полинуклеотид лигазадан фойдаландилар. Бу фермент хужайрада ДНК, АТФ, қайнатилган ичак бактериялари аралашмаси, магний ионлари ва фермент никотинамидаденидинуклеотид (НАД) бўлгандагина ўз вазифасини бажарар экан.
Г. Корона ва унинг хамкасблари 1960-1968-йилларда унча узун бўлмаган ДНК молекуласини кимёвий усулда хосил қилиш мумкинлигини аниқлаб, шу усул ёрдамида аланин т-РНК генини ва кейинчалик (1975-1976-йиллари) эса, хужайрада тўлиқ ишлай оладиган тирозин т-РНК генини синтез қилдилар. Генларни сунъий хосил қилиш усулларининг яратилиши ирсий касалликлари бўлган кишиларда шу касалликни келтириб чиқарувчи мутант генни соғлом ген билан алмаштириш имкониятини туғдирди. Аммо одамларда геномнинг мураккаблиги туфайли, хозирги кунда, унинг геномидан фақатгина кўп такрорланувчи генларнигина ажратиш мумкин бўлмокда. Ген инженериясида хужайрадан ажратиб олинган керакли ген кўчириб ўтказувчи ДНК сига, яъни вектор ДНКсига уланади. Одатда, ламбда бактериофаги хайвонларнинг айрим онкоген вируслари, бактерияларнинг плазмидаси ва эписомалари вектор сифатида ишлатилади. Рестриктаза ферментлари ёрдамида плазмида ДНК занжири бир биридан ажратилиб, унинг якка ДНК ипи майда бўлакларга бўлинади. Рестриктаза ферментларининг 50 дан ортиқ хили бўлиб, хар бирининг ДНК молекуласида ўзининг таъсир кўрсатадиган, яъни узадиган жойи бор. Шулар ичида энг кўп ишлатиладигани рестриктаза ЭcоРи дир. Бу рестриктазани ишлатишнинг қулайлиги шундаки, у ДНК молекуласининг фақат маълум бир жойини, яъни аниқроғи аденин ва тимин орасидаги боғни узади. Натижада, якка ипли ДНК нинг бошка ДНК бўлаги билан осон бирлашадиган майда бўлаклари пайдо бўлади ва бу бўлакларда нуклеотидларнинг жойлашиши биттасида фақат аденинли асосдан бошланса иккинчиси фақат тиминдан бошланади (44-расм). Бошқа ДНК бўлагини ўзига осонгина бирлаштирадиган ДНК бўлаги ва ажратилган, яъни керакли генни лигаза ферменти бўлган эритмага солинади. Лигаза ферменти керакли генни,шу генникўчирувчи плазмида ДНК сига улайди. Натижада хар хил ДНК ли (химер) плазмида хосил бўлади. Улар энди шундай плазмидаларни ўзига қабул қилувчи хужайралари (ретсипиентлар) бўлган совуқ холдаги калций хлор эритмасига туширилади.
Агар эритмани тезлик билан қиздирилса, хужайралар пўстининг хужайра учун бегона бўлган моддаларни киритмаслик хусусияти йоқолади. Шунинг учун хар хил ДНК си бўлган плазмида бактерия хужайрасига осонгина кириб, унинг ДНКсига бирлашиб олади. Шу бактерия хужайраси бўлганда ундан хосил бўлган янги хужайралар энди олдингиларига ўхшаш бўлмайди. Рестриктаза ферменти таъсирида узилган ДНК молекуласи бўлакларининг охирги қисми бир хил бўлади. Шунинг учун лигаза ферменти уларга бир хилда таъсир килиб, бу бўлакларни ва хаттоки, битта рестриктаза узган хар хил плазмидалар ДНК сининг бўлакларини хам хар хил тартибда бир-бирига улайди. Натижада, қуйидаги холатларни кузатиш мумкин:
плазмида ДНК бўлаклари қайта тикланганда олдинги тартибини хосил қилмайди, иккита ДНК бўлаги ўртасига бошқа организм ДНК сининг бўлаги кириб қолиши мумкин; битта организм ДНК бўлаги билан иккинчи организм ДНК сининг бўлаклари кетма-кет
жойлашади. С.Коен ва Э. Чанг биринчи бўлиб, хар хил ДНК си бўлган (химер) плазмидани хосил қилдилар. Бунинг учун икки хил бактериядан яъни ичак ва стафилококк бактерияларидан фойдаланилди. Ичак бактериясининг плазмидасида (пСГ 101) тетроциклинга, стафилококк бактериясининг плазмидасида Галактоза флерони Вирус ламбдаСВ 40 фаги Эндонуклеаза Экзонуклеаза Охирги трансфераза Дурагай молекула (яна тўртта узилган жой бор) ДНК-полимераза ДНК-лигаза

Халка холидаги дурагай молекула

44-расм. Галактоза оперони бўлган ламбда фаги ДНК си билан СВ 40 вирусли ДНК ларидан дурагай ДНКмолекуласини олиш.
(РСФ 1010) эса стрептомитсинга чидамлиликни юзага чиқарувчи ген бор. Бу иккала бактерияларнинг плазмидалари ДНК сининг бир-бирига бирикишидан дурагай плазмида хосил бўлиб, у энди тетрациклинга хам, стрептомитсинга хам чидамли бўлиб чиқди. Бу дурагай плазмидани ичак бактерияси худди ўзининг ДНК си каби қабул қилди.Натижада ичакбактериясининг хусусияти ўзгариб, стрептомитсинга хам, тетрациклинга хам чидамли бўлиб қолди (45- расм).



45-расм.

Керакли ген уланган вектор ДНК сини хужайрага ёки организмга ўтказишнинг (трансгеноз) тўртта йўли бор. 1 - трансформатсия; 2 - трансдуксия; 3 - содда хайвонлар, бактерияларнинг конюгатсияси ва юқори организмларни дурагайлаш; 4 - трансгрессия - хужайрага кирган вируснинг геномга бирикиши ва ундаги генлар таъсирининг юзагачикиши. Трансформатсия, трансдуксия, соматик хужайраларни дурагайлаш ходисалари билан юқорида тўлиқ танишган эдик.

Хужайра инженерияси. Бирон организмнинг соматик хужайраларига кўчириб ўтказилган ген шу организмнинг айрим хужайраларидагина бўлса, жинсий хужайралар орқали ўтказилган ген эса организмнинг барча органларида учрайди.
Хужайрага генни ёки хромосомани ўтказиш 1970-йилларда липосомаларнинг (липид пуфаклари) синтез қилиниши билан амалга оширила бошланди. Липосомалар иккита липид каватидан иборат бўлиб, хар хил моддаларни хужайрага киритишда кенг ишлатила бошланди. Липосомалар ичидаги моддалар, шу жумладан, хромосомалар узоқ сақланиши мумкин. Липосома мембранаси харорат таъсирида ўз холатини ўзгартиради ва ичидаги хромосомани хужайрага чиқаради.
Алохида генларни ажратиб ўтказишдан кўра хромосомани хужайрага ўтказиш осонроқ. 1978-йили липосомалар ёрдамида одамнинг хромосомаси сичқон хужайрасига ўтказилди. Бунинг учун одам соматик хужайрасининг битта хромосомасини липосомага киритилди ва бу липохромосомани гипоксантингуанинфосфорилбозилтрансфераза (ГТФТ) ферменти бўлмаган ва синъий ўстирилаётган сичкон хужайралари билан аралаштирилди. Вақт ўтиши билан сичқон хужайраси ядросида одам хромосомасининг пайдо бўлганлиги кузатилди.
Одам хромосомасидаги генлар таъсирининг юзага чиққанлиги ГГФТ ферменти бўлмаган сичқон хужайраларида ГГФТ ферментининг пайдо бўлиши билан исботланди. Хромосома одамники, хужайра эса сичқонники бўлган хужайрада синтез қилинган ГГФТ ферменти одамларда учрайдиган шу ферментга айнан ўхшаш эди. Демак, одам хромосомасидаги генлар сичқонлар хужайрасида хам ўз фаоллигини сақлаб қолади. Шундай қилиб, липосомалар ёрдамида хужайра даражасидаги ирсий касалликларни даволаш йўлларитопилди. Масалан, оғир нерв касалликларидан Тей-Сакскасаллиги биланоғриган одам хужайрасида Б-Н-асетил-гексозаминаза ферменти бўлмайди. Соғ одамда бу фермент лизосомаларда учрайди. Бу ферментни липосомага киритиб сунъий ўстирилаётган ва шу фермент бўлмаган хужайралар билан аралаштирилади. Вақт ўтиши билан липосома хужайра пўстидан ўтиб цитоплазмага тушади ва лизосомалар томонидан қамраб олингач унинг ичида қолади. Натижада хужайрада Б-Н-асетилгексозаминаза ферменти пайдо бўлади. Тей-Сакс касаллигида асосан бош мия нерв хужайралари жарохатланади. Маълумки, нерв хужайралари пўстидан бегона моддалар жуда қийинчилик билан ўтади. Шунинг учун бу касалликни даволаш анча оғир хисобланади.Ирсиятни организм даражасида қайта тузиш. Янги генетик усулларнинг пайдо бўлиши билан ирсиятни организмдаражасида қайта тузиш имконияти туғилди. Дж. Гордон (1962) биринчилардан бўлиб, вояга етмаган бақанинг (думли даврида) эпителий хужайра ядросини ядроси олинган бақанинг тухум хужайрасига кўчириб ўтказди (46-расм).
Бундай тухум хужайрадан эмбрион ривожланиб, ёш думли бақа хосил бўлди. У эса вояга етган бақага айланиб, кўпая бошлади. Ядросиз тухум хужайрага шу организмнинг соматик хужайра ядросини кўчириб ўтказиш билан генотипи бир хил бўлган организмларни олиш мумкин. Агар шу усулни сутемизувчиларда ўтказилса, жуда катта амалий фойдага эришиш мумкин. Чунки қорамоллар, қўйлар ва бошқа қишлоқ, хўжалик хайвонлари орасида серсут, серёғ, сержун, гўштдорлар учрайди. Жинсий кўпайиш пайтида бу яхши белгилар юзага чиқмаслиги мумкин. Сермахсул хисобланган битта хайвон соматик хужайрасидан олинган диплоид ядрони кўплаб ядросиз тухум хужайраларга ўтказиб, сермахсул хайвонлар сонини кўпайтириш мумкин. Лекин бу усулни юқори организмларда қўллаш анча ноқулай, чунки уларнинг тухум хужайраси бақаникига қараганда жуда кичик ва бақаникига ўхшаш оталаниши хамда ривожланиши сувда кечмайди, шунинг учун соматик уруғланмаган тухум хужайра итбалиқитбалиқнинг Ултрабинафша ичаги нур таъсир этиш Ичак хужайралари Микропипетка Ретсипиент-тухум Ичак хужайрасининг хужайра ядроси Бластула Бластула Бўлиниш ёък
РивожланмаганИтбалик эмбрионВояга етган бақа

46-расм. Ичак эпителийси хужайрасининг ядросини бақанинг уруғланмаган тухум хужайрасига кўчириб ўтказиш ва ундан етук организмнинг ривожланиши. хужайра ядросини ўзига қабул қилган тухум хужайрани хайвонларнинг бачадонига ўтказиш керак бўлади. Организм даражасида ўтказилган генетик инженерияга Э. Мак-Лореннинг аллофен (организмида хар хил ота-онадан олган, яъни хар хил ирсий омили бўлган организмлар) сичқонларни яратиш тажрибасини кўрсатиш мумкин. Эмбриони 8 табластомера холатида бўлган организм эмбрионига проназа ферментини таъсир эттириб, бластомерлариниалохида-алохида қилиб ажратилади. Шу усул билан бир-биридан ажратилган битта сичконнинг эмбрион бластомерлари бошқа сичконнинг шу йўлда ажратилган бластомерларига қўшилади ва улардан яхлит эмбрион олинади

(47-расм).

47-расм

Расмда оқ ва қора сичқон бластомерларининг қўшилишидан олачипор (аллофен) сичқоннинг пайдо бўлиши кўрсатилган. қора ва оқ сичконлар бластомерларининг бирга қўшилишидан хосил бўлган муртакни гаструлатсия даврида пробиркадан урғочи сичқоннинг бачадонига кўчириб ўтказилди. Шу муртакдан ривожланган сичқон боласида хар икки ота-онанинг хам генетик хусусиятлари пайдо бўлиб, ранги олачипор бўлади. Аллофен сичқонларни 3 та, 4 та ва ундан хам ортиқ организмлар эмбрионининг бластомерларини қўшиб хам олиш мумкин. Ирсиятни популатсия даражасида қайта кўриш. Хозирги кунда тиббиётдаги кўпгина жараёнлар (тиббий-генетик маслахат, ёш болаларнинг ўлимига қарши кураш, одамларда туғилишни бошқариш ва бошқалар) одам популатсиялари генофондига таъсир кўрсатмоқда. Англияда 1978-йили П. Стентоу ва Р. Эдварслар пробиркада тухум хужайраларни уруғлантириб, шу уруғланган хужайрани уч кундан кейин аёл бачадонига кўчириб ўтказдилар. Орадан тўққиз ой ўтгач онадан соғлом қизалоқ туғилди.

Хозирги кунда фақат АКС нинг ўзида хар йили 25 мингга яқин фарзандсиз аёлларни сунъий уруғлантирилади ва улардан 10 мингга яқини фарзандли бўлмокда. Бунинг учун соғлом эркаклардан уруғ олиниб, махсус идишларда сақланади. Бу масалалар методик томондан яхши хал қилинган бўлсада, унинг этика масалалари ечилган эмас (масалан, уруғни кимдан олиш керак ва хоказо). Лекин тиббий-генетик маслахатлар туфайли ирсий касалликларнинг олди олинмоқда.
Г. Финк бактериядаги лейсин аминокислотасини хосил бўлишини бошқариб турувчи генни шундай гени бўлмаган замбуруғ хужайрасига ўтказди. 1971-йили америкалик олимлар К. Мерил, Геер ва Петричиани ичак бактериясидаги галактоза-1-фосфат уридилтрансфераза генини сунъий ўстирилаётган одам хужайраларига ўтказдилар. Бу билан олимлар моддалар алмашинувини бузилишига олиб келадиган оғир туғма касалликларни даволаш учун йўл очдилар.
Хозирги кунда айрим генларни синтез ўилишнинг бир қанча усуллари ишлаб чиқилди. Масалан, қуённи қизил қон таначаларидан полирибосомалар, улардан эса глобин и-РНК си (гемоглобиннинг оқсил қисми) ажратиб олинди. Шундан кейин ДНК полимеразанинг РНК - тобе вирус ферменти ёрдамида биринчи бўлиб ана шу и-РНК нинг ДНК нусхасини синтез қилдилар. Ирсий касалликларни даволашда хар хил биологик фаол моддалар керак бўлади. Агар бу моддалар одамнинг ўзидан олинса
одамларга хар хил вирусларнинг юқиш хавфи туғилади. Масалан, гемофилия касаллигини даволаш учун одам қонидан ишлаб чиқилган дорилар таркибидан СПИД касаллигининг вируси топилган. Биологик фаол моддаларни хайвон хужайрасидан олиниб кейин одамга юборилса ретсипиентнинг иммунологик системаси бу моддаларни қабул қилмаслиги мумкин. Шунинг учун бу биологик фаол моддалар фақатодамники бўлиши керак. Буни генетик инженерия усуллари ёрдамидагина хал қилиш мумкин. Хозирги кунда ген инженерияси усулларидан фойдаланилган холда тиббиётда ишлатиладиган ўнга якин оқсиллар синтез қилинмоқда (инсулин, ўстирувчи гормон, интерферон, интерлейкин, профиринолизинни фаолаштирувчи оқсил, Б-гепатитга қарши ваксина, яшур касаллигига қарши ваксина, а-антитрипсин, гемофилия касаллигини даволашда ишлатиладиган ИХ ва ВИИИ кон омиллари). Ген инженериясидан яна тиббиётда ирсий касалликларни аниқлашда хам фойдаланилади. Нормадаги геннинг нуклеотидлар тартибини билган холда, у ўзгарганда ундаги нуклеотидларни жойлашиш тартибининг ўзгариши аниқланди.
Биотехнология. 1970-йилларда молекулар генетика, хужайра биологияси ва кимёси ютуқларига асосланган ишлаб чиқариш усули - биотехнология пайдо бўлди. Лекин биологик усулда ишлаб чиқариш жараёни қадим замонлардан бизга маълум. Масалан, нон, вино, сут махсулотлари, пишлоқ ишлаб чиқариш, бижғитиш, тиббиётда ишлатиладиган дориларни ишлаб чиқариш ва бошқалар биотехнологик жараёнлар бўлиб, бошқа ишлаб чиқариш усулларига қараганда энергия ва хом ашёни кўп талаб қилмайди. Биотехнологиянинг яна бир қулайлик томони шундаки, бу жараён
натижасида хосил бўлган чиқиндилар кам ва улар албатта яна бир бошқа максадлар учун ишлатилади. Биотехнология кейинги йилларда генетик инженериянинг ютуқларига суянган холда янада ривожланмокда. ДНК молекуласини ишлаб чиқарувчи тармоқлар яратила бошланди. Шундай тармоқлар дастлаб 1976-йили Америкада, кейинчалик эса, Европада ва Японияда пайдо бўлди. Биотехнология жараёнларидан микробиология саноати, ўсимлик ва хайвон целексиясида ферментлар ишлаб чиқариш саноати, озиқ-овкат саноати, тиббий дори-дармонлар ишлаб чиқариш ва бошқа сохаларда кенг қўлланилмокда. Хозирги кунда биотехнология усуллари асосида кўплаб (4500 га яқин) антибиотиклар олиш йўлга кўйилган.