Termiz davlat universteti tabiiy fanlar fakulteti

Protokol bosqichi	Klassik MPFP ning kamchiliklari
Usulni optimallashtirish mexanizmlari
MPFP mahsulotlari	Past zichlikdagi denatura jellarida fraktsiyalash (PCR parchalarining saqlanishini kamaytirish, jarayonlarning murakkabligini oshirish)	MPFP mahsulotlarini o'rtacha zichlikdagi (8% akrilamid) denaturatsiyasiz jellarda fraktsiyalash protokolini ishlab chiqish)
Mahsulotni ingl IFFP	PCRda radioaktiv yorliqli astarlardan foydalanish (toksiklik, yuqori material va vaqt xarajatlari)	DNK fragmentlarini to'g'ridan-to'g'ri jelda vizualizatsiya qilish bilan markirovka qilinmagan primerlardan olingan PCR mahsulotlarini aniqlash bo'yicha protokol ishlab chiqish - o'rtacha zichlikdagi denaturatsiyalanmaydigan jellarni kumush nitrat bilan bo'yash.
	Radio avtografiya yordamida signalni aniqlash (vaqt xarajatlari, biologik material tashuvchisi - gel - va vizual ma'lumot tashuvchisi - radio avtografning fazoviy ajratilishi)
Sekvensiyaga tayyorgarlik MPFP mahsulotlari	DNK parchalarini klonlash (keraksizlikni talab qiladigan ko'p bosqichli jarayon затрат vaqt, sarf materiallari va uskunalar)	PCP mahsulotlarini MPPP uchun ishlatiladigan primerlardan qayta kuchaytirish,после MPFP mahsulotlarining o'ziga xos qirralarini oldindan aniqlash.

MPPP usuli bilan yaratilgan genom vakilliklarining tarkibi
MPPP usulining ishlab chiqilgan modifikatsiyasidan foydalangan holda, ko'krak bezi saratoniga chalingan bemorlarning 40 juft (normal + o'simta) DNK namunalari tahlil qilindi va kamida bitta MspI cheklash endonukleazni aniqlash joyini o'z ichiga olgan 43 ta parcha aniqlandi. Ushbu fragmentlar orasida 25 (58%) metillangan va 11 (26%) barcha namunalarda metillanmagan. Differentsial metillanish namunalarning kamida bittasida 7 (16%) bo'laklar uchun ko'rsatilgan. Usulning ishlab chiqilgan modifikatsiyasi yordamida differentsial metillangan DNK fragmentlarini aniqlash samaradorligi boshqa mualliflar tomonidan olingan natijalar bilan taqqoslanadi. Demak, Liangning ishida, MPP usulini qo'llashga asoslangan (Gonzalgo M.L. va boshq., 1997), differentsial metillangan bo'laklar olingan parchalarning umumiy sonining 13,5% ini tashkil etgan (Liang G. va boshq, 1998). Bizning usulimizning yuqori samaradorligi eksperiment uchun tanlangan primer ketma-ketliklarning muvaffaqiyatli dizayni va MPPP vakolatxonalarini ajratish uchun qo'llaniladigan usulning o'lchamlari etarliligini ko'rsatadi.
Aniqlangan differentsial metillangan bo'laklarni to'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlashtirish natijalari ularning ketma-ketligini kompyuter tahlilini o'tkazishga imkon berdi, shu asosda ular LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CpG orollari mintaqalari sifatida aniqlandi. CACNG4 va PSMF1 genlari. Ko'krak bezi saratonida ushbu CpG orollarining g'ayritabiiy metilatsiyasi birinchi marta namoyish etildi. Ushbu genlardan faqat bittasi - o'simta o'sishini bostiruvchi BIN1 kanserogenezda ishtirok etganligi isbotlangan (Ge R. va boshq., 1999), boshqa genlarning molekulyar patologiyasining saraton kasalligidagi rolini o'rganish aniqlanmagan. amalga oshirildi; bajarildi.
Olingan natijalar shuni ko'rsatadiki, optimallashtirilgan MPPP usuli kanserogenez paytida g'ayritabiiy metilatsiyaga uchragan yangi genlarni samarali aniqlashga imkon beradi. Shu bilan birga, MPPP tabiatining o'zida bir qator tuban muqarrar kamchiliklar mavjud. Xususan, ko'rsatilganidek, genomning differentsial metillangan hududlariga mos keladigan MPPP mahsulotlari o'rtacha hisobda MspI cheklash fermentini tanib olish joylarini o'z ichiga olgan barcha reaksiya mahsulotlarining 15% dan ko'pini tashkil qiladi. Umumiy vakillik fonida differentsial metillangan bo'laklarning ulushi bir necha foizdan oshmaydi. Shunday qilib, FPP vakili elementlarini ajratish maydonini asosan informatsion bo'lmagan elementlar egallaydi, ularning ulushi 95% dan oshishi mumkin. MPFP ning ikkinchi tizimli kamchiliklari bu usulni eng kichik standartlashtirishga imkon bermaydigan statistik primerlardan foydalanish.
2000-yillarning boshlariga kelib. Samaradorligi jihatidan MPPP dan kam bo'lmagan va o'ziga xos kamchiliklaridan mahrum bo'lgan genomlarning differentsial metilatsiyasini skrining qilish usulini ishlab chiqish zarur. 2002 yilda ispaniyalik tadqiqotchilar tomonidan intermetillangan joylarni (AIMS) adapter vositasida kuchaytirishga asoslangan bunday texnologiya nashr etildi (Frigola J. va boshq., 2002).
AIMS uslubini tanqidiy tahlil qilish amalga oshirildi, natijada aslida nafaqat o'zgartirilgan AIMS usulini, balki kuchaytirilgan fragmentlar uzunligini tahlil qilishning tubdan yangi texnologiyasini - AFLOAT (Amplified Fragment Length Oriented Analysis Technique) yaratildi. , bu DNKning differentsial metilatsiyasini va genomik dasturlarni o'rganish uchun ham ishlatilishi mumkin.
Xulosa.
Tibbiy genomikaning muvaffaqiyatli rivojlanishi mutatsiyalarning biologik va tibbiy ahamiyatini, genetik qayta tuzilishini, ularning sog'liq holati bilan bog'liqligini, kasallikdan oldin va turli patologiyalarni aniqlashga, diagnostika, profilaktika va terapiyaga yangi yondashuvlarni ishlab chiqishga imkon beradi. DNK va RNK molekulalarini (Ion torrenti, Illumina, RNK-seg) tez sekvensiya qilishning yangi usullarini, mikroarray texnologiyasini va bioinformatikani ishlab chiqish va tibbiy amaliyotga joriy etish tibbiyotning deyarli barcha sohalarida rivojlanishni ta'minlaydi. Hozirgi kunda AQSh va Evropada molekulyar genetik tadqiqotlarni, shu jumladan inson genomini to'liq sekvensiyalashni (masalan, 23 va Me, AQSh) tezkor va samarali bajaradigan yirik biomedikal kompaniyalar faoliyat yuritmoqda [49, 55]. Shu bilan birga, bunday tadqiqotlarni o'tkazish, natijalarni baholash va sharhlash uchun talablar ishlab chiqilmoqda [53, 55]. Rossiya, Ukraina va Belorussiya olimlari va amaliyotchilari ushbu yo'nalishda ish boshlashmoqda. Shu nuqtai nazardan, ushbu texnologiyalarning iste'molchilari jismoniy shaxslarning PGS narxining asta-sekin pasayishini kutmoqdalar (tez orada - 1000 dollar, keyin esa 300 va hatto 100), bu ko'plab keng tarqalgan muntazam laboratoriya tahlillari narxi bilan taqqoslanadi. Genomika bo'yicha tadqiqotlarning tijoratlashtirilishi yangi xizmat turini, yangi mulk huquqlarini (genlarning birlamchi tuzilishiga, yangi testlarga) bozor yaratadi, fundamental tadqiqotlar natijalarini amaliyotga tatbiq etishni tezlashtiradi.
Sog'lom shaxslar va turli xil kasalliklarga chalingan bemorlarning PGS natijalarini bosqichma-bosqich to'plash milliy ma'lumotlar bazalarini shakllantirish, ma'lum bir patologiyaga xos bo'lgan genetik o'zgarishlarni tahlil qilish va aniqlash va ushbu natijalardan profilaktika va klinik maqsadlarda foydalanish imkonini beradi. Aholining genomiga oid yangi ma'lumotlar vaktsinalarni ishlab chiqish va immunizatsiyalashda genomga yo'naltirilgan yoki shaxsiylashtirilgan yondashuvlar tamoyillari uchun foydali bo'ladi. Intellektual nuqsonlari, ruhiy kasalliklari, autizm, tug'ma nuqsonlari, molekulyar genetik mexanizmlarni yaratish va ularning sabablari bo'lgan bolalar va kattalarning genom darajasida laboratoriya diagnostikasi yanada qulay va odatiy holga aylanadi [58, 59].
Farmakogenomika, yangi dori vositalari va qo'llanmalarini yaratish sohasida alohida yutuqlar kutilmoqda. Ba'zi dorilar bilan terapiyaga javob bermaydigan bemorlarda PGS genomlarining jadal rivojlanishi bu hodisani bartaraf etish sabablari va usullarini aniqlashga imkon beradi. Ko'pgina dori vositalaridan foydalanish samaradorligi hozirda taxminan 30-60% gacha baholanmoqda. PSG natijalarini giyohvand moddalarga haddan tashqari reaktsiyasi bo'lgan bemorlarda qo'llash qiziq tuyuladi [60, 61]. Bolalar genomidagi genetik o'zgarishlarni ota-onalarining genomlari bilan qiyosiy tahlil qilish ota-ona mutatsiyasining spektrini ochib beradi, shuningdek, yangi individual o'zgarishlarni kashf etadi, bu genotipning irsiy va genezisdagi rolini yaxshiroq tushunishga yordam beradi. orttirilgan kasalliklar. Yosh juftliklar PSJ natijalaridan oilani rejalashtirishda foydalanishlari mumkin bo'ladi. Tibbiy genomikaning keyingi rivojlanishi sud ekspertizasida kuzatiladi, bu genetik identifikatsiyani amalga oshirish, irsiyatni (otalik, onalik) o'rnatishga imkon beradi [61, 62]. Ushbu yo'nalishdagi yutuqlarni amaliyotga bosqichma-bosqich joriy etish tibbiy genomika bo'yicha yangi avlod mutaxassislarini tayyorlash, laboratoriya va klinik shifokorlar uchun maxsus o'quv kurslarini ishlab chiqish bilan chambarchas bog'liq [63].
Inson populyatsiyasida genetik o'zgarish darajasi nisbatan past - taxminan 1%, ammo dominant va noyob mutatsiyalarni aniqlash, ularning rolini va inson salomatligi uchun qo'shimcha xavfni baholash muhimdir [64]. Umumiy biologik nuqtai nazardan, insoniyat evolyutsiyasi tarixini - ajdodlar populyatsiyasining genetik tuzilishi, sayyoralarning tarqalishi, xalqlarning kelib chiqishi, gominidlar bilan aloqalari, yuqumli kasalliklarga, nurlanishga sezgirligi va boshqalarni tiklash muhim ahamiyatga ega [62, 63, 65 ]. Ushbu sohalarni rivojlantirish keng va chuqur ilmiy izlanishlar, tushuncha va usullarni takomillashtirish bilan birga bo'ladi - ko'p miqdordagi ma'lumotlarni tahlil qilishdan tortib, hamma uchun shaxsiylashtirilgan genomika.