Сборник содержит материалы научной мультиконференции «Биотех- нология медицине будущего»

Природные модифицированные нуклеотиды в составе
направляющих РНК для модулирования свойств искусственных
регуляторов экспрессии генов
Журавлев Е.С.
1
, Вохтанцев И.П.
1,2
, Устьянцева Е.И.
1,2,3
, Кулишова Л.М.
1
, Семенов Д.В.
1
, 
Жарков Д.О.
1,2
, Степанов Г.А.
1,2
1
Институт химической биологии и фундаментальной медицины,
Новосибирск, Россия 
2
Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия 
3
Институт цитологии и генетики, Новосибирск, Россия
Стратегия включения модифицированных нуклеотидов в структуру искусственных 
регуляторов экспрессии генов на основе РНК широко распространена при конструи-
ровании аналогов различных классов РНК. Введение модификаций позволяет избира-
тельно корректировать свойства получаемых молекул РНК.
Первоначально данный подход был применен нами для выявления особенностей 
функционирования в клетках человека ряда малых ядрышковых C/D-бокс-РНК.
С целью устранения неспецифических цитотоксических эффектов, вызываемых 
немодифицированными аналогами мяоРНК, были получены РНК, содержащие в своей 
структуре модифицированные нуклеотиды: m
6
A, m
5
C и Ψ. Было установлено, что 
введение Ψ и m
5
C в структуру искусственных коротких нкРНК существенно снижает 
их иммуностимулирующее действие. Для подтверждения наблюдаемого эффекта 
проводили оценку изменений в экспрессии генов методами полнотранскриптомного 
анализа и ОТ-ПЦР, а также сравнение пролиферации клеток в реальном времени в 
условиях трансфекции полученными РНК. Кроме того, было показано, что модифи-
цированные РНК в меньшей степени активируют клеточные рецепторы PKR и RIG-I 
по сравнению с немодифицированными аналогами. Обнаруженный эффект связан с 
повышением термодинамической стабильности элементов вторичной структуры РНК 
при включении модифицированных нуклеотидов [1].
Полученные результаты и разработанные стратегии синтеза были использованы 
для получения sgРНК, обеспечивающих целевое действие нуклеазы Cas9 в модельных 
системах редактирования заданных генов. С использованием web-инструмента TIDE 
было показано, что введение модификаций (m
6
A, m
5
C и Ψ) в структуру sgРНК не 
снижает эффективность работы комплексов Cas9/sgРНК при трансфекции их в клетки 
человека. Кроме того, модифицированные мономеры снижали иммуностимулирующее 
и цитотоксическое действие sgРНК. Результаты, полученные в экспериментах in 
vitro с использованием рекомбинантного белка SpCas9 и модифицированных sgРНК, 
позволили заключить, что введение модификаций в структуру sgРНК изменяет соотно-
шение активностей доменов RuvC и HNH.
Таким образом, применение модифицированных нуклеотидов, с одной стороны, 
позволяет корректировать свойства регуляторов экспрессии генов и, с другой стороны, 
дает новую информацию о взаимодействии природных и искусственных РНК с белка-
ми-партнерами.
1. Stepanov G.A., Zhuravlev E.S. et al. // Genes. 2018. V. 9. 531.
Исследование выполнено при частичной поддержке проекта базового бюджетного фи-
нансирования Минобрнауки РФ (0245-2019-0001) и гранта Президента РФ для молодых 
российских ученых (МК-6196.2018.4).

---

Всероссийская мультиконференция с международным участием «Биотехнология – медицине будущего»
29 июня - 2 июля 2019 г., г. Новосибирск, Россия
37