Сборник содержит материалы научной мультиконференции «Биотех- нология медицине будущего»

Флуоресцентно-меченные красителями ближнего ИК диапазона 
дезоксиуридинтрифосфаты для двухиндикаторного метода
молекулярно-генетического анализа
Шершов В.Е., Кузнецова В.Е., Лапа С.А., Чудинов А.В.
ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской 
академии наук, Москва, Россия
Исследование множественных олигонуклеотидных полиморфизмов возбудителя 
туберкулеза, коррелирующих с резистентностью возбудителя к определенным лекар-
ственным средствам, относится к числу методов, для которых повышение чувствитель-
ности, воспроизводимости и надежности анализа крайне актуальны. В подобного рода 
исследованиях получил развитие метод, основанный на мультиплексной ПЦР с после-
дующим связыванием продуктов амплификации с матрицей иммобилизованных олиго-
нуклеотидных зондов на биологических микрочипах. В этом методе в качестве индика-
торной метки для визуализации результатов анализа используются флуоресцентные 
красители. 
Для повышения точности анализа и контроля качества изготовления и хранения тест-
систем на основе биочипов предложена двухиндикаторная система анализа и контроля, 
включающая флуоресцентное маркирование иммобилизованных на полимерной под- 
ложке олигонуклеотидных зондов индокарбоцианиновыми красителями, флуоресциру-
ющими в области 550-600 нм (Cy3), и флуоресцентное маркирование продуктов ПЦР 
индотрикарбоцианиновыми красителями ближнего ИК диапазона с максимумами флуо- 
ресценции в диапазоне 750-800 нм (Cy7). Выбранные спектральные диапазоны не пере-
секаются и позволяют независимо анализировать количество иммобилизованных 
олигонуклеотидных зондов и гибридизуемых на биочипе продуктов амплификации.
В данной работы синтезировали дезоксиуридинтрифосфаты флуоресцентно-мече- 
нные красителями Cy7. Для этого синтезировали 2 водорастворимых дисульфирова-
ных карбоксилсодержащих индотрикарбоцианиновых красители с пропил- и пенти-
ламмониевыми заместителями в положении 1 индоленинового фрагмента. Красители
в фосфатно-солевом буферном растворе при рН 7.4 имеют максимумы поглощения
744 нм и 749 нм, максимумы флуоресценции 767 нм и 770 нм, коэффициенты молярной 
экстинкции 200000 и 248000, квантовые выходы флуоресценции 0.27 и 0.29. Красители 
обладают термо- и фотостабильностью достаточной для использования в условиях 
ПЦР и гибридизационного анализа. Красители перевели в активные производные
в виде соответствующих 
п
-нитрофениловых эфиров и сконденсировали в водно-органи-
ческой среде с 5-аминоаллил-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфатом. Полученные флуорес-
центно-меченные дезоксиуридинтрифосфаты добавляли в ПЦР к используемым 
dNTP. Установлено, что маркированные трифосфаты выдерживают условия ПЦР, 
не ингибируют полимеразу и эффективно встраиваются в продукты амплификации
в соответствии с матрицей копирования.
Работа выполнена при финансовой поддержке «Стипендии Президента Российской
Федерации для молодых ученых и аспирантов, осуществляющих перспективные научные 
исследования и разработки по приоритетным направлениям модернизации российской 
экономики на 2018-2020 г.г.»

---

Всероссийская мультиконференция с международным участием «Биотехнология – медицине будущего»
29 июня - 2 июля 2019 г., г. Новосибирск, Россия
224