Сборник содержит материалы научной мультиконференции «Биотех- нология медицине будущего»

Мультимеризация ДНК под действием ДНК полимеразы Bst exo-
и способы ее устранения
Гарафутдинов Р.Р.
1
, Гильванов А.Р.
1
, Фазлетдинова З.Н.
1
, Сахабутдинова А.Р.
1
, 
Купрюшкин М.C.
2
, Пышный Д.В.
2
1
Институт биохимии и генетики УФИЦ РАН, Уфа, Россия 
2
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,
Новосибирск, Россия
Амплификация нуклеиновых кислот стала рутинным методом, используемым как 
в фундаментальных научных исследованиях, так и в практических областях (медицине, 
криминалистике и пр.). На сегодняшний день предложено огромное количество 
различных методов амплификации ДНК и РНК. В последнее время все больший интерес 
вызывают методы изотермической амплификации, особенностью которых является 
использование ДНК полимераз с цепь-вытесняющей активностью. Одной из самых 
популярных является ДНК полимераза Bst exo- (большой фрагмент ДНК полимеразы I
из 
Geobacillus stearothermophilus
). Несмотря на ряд присущих ей преимуществ, она 
обладает существенным недостатком – способностью давать мультимерные продукты 
на линейных ДНК-матрицах, что характерно для реакции амплификации катящимся 
кольцом [1]. 
Нами было показано, что мультимерные продукты представляют собой тандемно 
расположенные последовательности исходной ДНК-матрицы с редукцией ее концевых 
фрагментов; размер делеций варьирует в зависимости от различных факторов. 
Наибольшая эффективность мультимеризации наблюдалась для полимеразы Bst 2.0, 
при 55-60°С, при проведении реакции в объеме 15-20 мкл. Оптимальная для протекания 
мультимеризации длина ДНК мишени составляет 51 нуклеотид. Оказалось, что SYBR 
Green I в концентрации свыше 0,25× ингибирует мультимеризацию.
С помощью молекулярного докинга в три- и тетрануклеотидном приближении, 
а также экспериментально на мишенях с разной нуклеотидной последовательностью 
была изучена предпочтительность связывания полимеразы Bst exo- c ДНК. Для 
комплексов, состоящих из закрытой формы Bst полимеразы и двуцепочечных трину-
клеотидов с метилфосфатными группами по 5’- и 3’-концам дуплекса, выявлена предпо-
чтительность связывания активного центра фермента с AT-богатыми нуклеотидными 
последовательностями. 
Была изучена возможность предотвращения мультимеризации с помощью прай- 
меров, содержащих фосфорилгуанидиновую группу (Tmg). Оказалось, что одна Tmg 
не сказывается на эффективности полимеризации, а полное ингибирование элонгации 
происходит при наличии трех и более расположенных подряд модификаций. Мульти-
меризация предотвращается при наличии трех и более модификаций по центру 
праймеров, а специфическая амплификация при этом не ингибируется.
Полученные данные могут позволить оптимизировать условия проведения изотер-
мической амплификации с Bst полимеразой с целью повышения специфичности 
реакции.
1. Wang G., Ding X., Hu J., Sun J., Mu., Y. Unusual isothermal multimerization and ampli-
fication by the strand-displacing DNA polymerases with reverse transcription activities // 
Sci. Rep. - 2017 - V. 7. - 13928.

---

Всероссийская мультиконференция с международным участием «Биотехнология – медицине будущего»
29 июня - 2 июля 2019 г., г. Новосибирск, Россия
68