Сборник содержит материалы научной мультиконференции «Биотех- нология медицине будущего»

Разработка методов для выявления 2’-O-метилированных нуклеотидов 
в составе природных РНК 
Прохорова Д.В.
1,2
, Журавлев Е.С.
1
, Можаева Е.В.
1,2
, Касакин М.Ф.
1
, Филиппова Ю.А.
1
, 
Степанов Г.А.
1,2
1 ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 
Новосибирск, Россия 
2 Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия
Пост-транскрипционные модификации в составе некодирующих РНК играют зна- 
чительную роль в регуляции обширного набора жизненно важных процессов в клетках. 
2ʹ-O-метилирование рибозы является одной из наиболее часто встречающихся модифи-
каций РНК. В настоящей работе было предложено три усовершенствованных подхода для 
выявления 2ʹ-O-метилирования отдельных нуклеотидов в составе протяженных РНК.
Первый метод основан на использовании 5ʹ-флуоресцентно меченных праймеров 
с последующим анализом продуктов терминации обратной транскрипции на автома-
тическом ДНК-анализаторе [1] Предложенный подход позволяет одновременно вы- 
являть модификации и проводить относительную оценку глубины 2ʹ-O-метилиро-
вания нуклеотидов. Таким образом, можно получать более полную информацию
о распределении модифицированных нуклеотидов в структуре протяженных участков 
(до 300-500 н.) РНК-матрицы. Второй подход представлен двухстадийной ОТ-ПЦР
в режиме реального времени с «неоптимальной» как пониженной, так и повышенной 
(>1,0 мМ) концентрацией дНТФ на первой стадии, позволяющий определять глубину 
2ʹ-O-метилирования отдельных нуклеотидов в составе РНК-матрицы. Третий подход 
основан на применении фермента РНКазы Н с последующим ферментативным гидро-
лизом и выявлением 2ʹ-O-метилированных нуклеотидов с помощью метода ВЭЖХ 
МС-МС [2]. С использованием предложенных подходов были выявлены различия
в глубине модификации нуклеотидов рРНК клеток человека, а также подтверждены 
изменения в глубине 2ʹ-O-метилирования нуклеотидов 28S и 18S рРНК человека
в клеточных линиях с нокаутом индивидуальных малых ядрышковых РНК. Дополни-
тельно был разработан метод выявления 2ʹ-O-метилированных нуклеотидов с исполь-
зованием фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов.
Разработанные подходы расширяют возможности использования методов выяв- 
ления 2ʹ-O-метилированных нуклеотидов природных РНК в исследованиях путей 
регуляции модификации РНК. 
1. Филиппова Ю.А., Степанов Г.А., др. Модифицированный метод анализа струк-
туры рРНК позволил выявить новые свойства аналогов C/D-бокс-РНК. // Acta 
Naturae - 2015. - V. 2. - p 69-78.
2. Филиппова Ю.А., Семенов Д.В., др. Современные методы выявления модифициро-
ванных нуклеотидов в РНК. // Биохимия - 2017. - V. 11. - p 1557 – 1576.
Исследование выполнено при частичной поддержке проекта базового бюджетного финан-
сирования Минобрнауки РФ (0245-2019-0001) и гранта РФФИ № 18-29-07073, на этапе 
разработки методов с применением фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов при под-
держке гранта РНФ № 18-14-00357.

---

Всероссийская мультиконференция с международным участием «Биотехнология – медицине будущего»
29 июня - 2 июля 2019 г., г. Новосибирск, Россия
206