Сборник содержит материалы научной мультиконференции «Биотех- нология медицине будущего»

Изучение одновременного ферментативного встраивания разноименных 
Cy5-модифицированных дезосксипиримидинов в ДНК
для гибридизационного анализа на биочипах
Лапа С.А., Шершов В.Е., Кузнецова В.Е., Чудинов А.В.
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва, Россия
Введение флуоресцентных меток в ДНК широко применяется в молекулярно-биоло- 
гических исследованиях и клинической диагностике. Широко распространены циани-
новые красители ряда Cy5, стабильные в условиях ПЦР. При ферментативном введении 
Cy5-модифицированных нуклеотидов в ДНК важным параметром является способ-
ность соответствующих трифосфатов (Cy5-dNTP) восприниматься ДНК-полимера- 
зами в качестве субстратов. Показано, что наиболее эффективной для введения 
Cy5-dUTP является концентрация 8 µM, или отношение модифицированый/природный 
трифосфат, равное 4% [1]. Разработка методов одновременного введения различных 
флуоресцентно-меченных нуклеотидов (например, dU и dC) в одну растущую цепь ДНК
позволит увеличить удельную плотность введения меток и повысит чувствительность 
анализа.
Нами исследовано одновременное ферментативное встраивание дезоксиуридина 
(Cy5-dU) и дезоксицитидина Cy5-dC, модифицированных одним и тем же флуоро-
фором (электронейтральное сульфопроизводное Cy5-ряда), связанным с 5-положением 
азотистого гетероцикла идентичными линкерами (лабораторное обозначение соеди-
нений dU2 и dC128). В качестве полимераз выбраны Taq и Vent (exo-) с отсутствующей 
3’-5’ экзонуклеазной активностью, что не позволяет этим ферментам выщеплять 
«ошибочно» встроенные неприродные Cy5-dN. Для оценки эффективности встра-
ивания Cy5-dN измеряли флуоресцентный сигнал меченой ДНК, гибридизованной
с зондами биологического микрочипа «ТБ-Биочип».
При индивидуальном независимом использовании Cy5-dUTP и Cy5-dCTP интен-
сивности сигналов сравнимы для обоих модифицированных dNTP при оптимуме 8 µM. 
Одновременное использование Cy5-dUTP и Cy5-dCTP в концентрации каждого 4 µM 
(суммарно 8 µM) приводит к интенсивности сигнала, как при независимом использо-
вании в концентрации 8 µM. Увеличение концентрации при индивидуальном исполь-
зовании до 16 µM приводит к снижению сигнала, вызванному ингибированием как для 
Cy5-dUTP, так и для Cy5-dCTP. Одновременное использование в концентрации каждого 
по 8 µM (суммарно 16 µM) не приводит к уменьшению сигнала, а напротив, к его увели-
чению в 1,5 раза по сравнению с независимым использованием в концентрации 8 µM.
Таким образом, показана возможность встраивания разноименных модифициро-
ванных dN в одну цепь ДНК. Одновременное использование трифосфатов обоих типов 
(Cy5-dUTP и Cy5-dCTP) приводит к заметному увеличению чувствительности гибри-
дизационного анализа.
1. Shershov V.E., Lapa S.A., Kuznetsova V.E., Spitsyn M.A., Guseinov T.O., др. всего 9 человек. 
Comparative Study of Novel Fluorescent Cyanine Nucleotides: Hybridization Analysis of La-
beled pCR products Using a Biochip. // J. Fluoresc. – 2017. – V. 27. - p 2001 – 2016.
Исследование поддержано грантом РФФИ № 19-04-01217.

---

Всероссийская мультиконференция с международным участием «Биотехнология – медицине будущего»
29 июня - 2 июля 2019 г., г. Новосибирск, Россия
185