Reja: immunoferment tahlil metodlari

IMMUNOFERMENT TAHLIL

REJA:

1. 
   IMMUNOFERMENT TAHLIL METODLARI
   
2. 
   IFA metodlari klasifikatsiyasi
   
3. 
   Antigenlarning analiz qilish
   

Hozirgi vaqtgacha prinsipial va ikkinchi darajali farqlari bilan IFA o’tkazishning katta miqdordagi, turli xil variantlari ishlab chiqilgan. Aniq ko’rib chiqilgan IFA metodlari obzorlari nashr qilingan. Shunda ham IFAning turli – tuman medotlarining aniq bir klassifikatsiyasi adabiyotlarda yo’q. Bu umumiy qonuniyatlarni va turli xil metodlarni qiyosiy baholashda qiyinchilik tug’diradi.

Odatda IFA metodlarini muhokama qilish barcha metodlarning geterogen va gomogenlarga bo’lish ya’ni tahlilning qattiq faza ishtiroki bilan yoki faqat suyuqlikdagi barcha bosqichlarni prinsp bo’yicha o’tkazish amalga oshiriladi.
IFA metodlari klassifikatsiyasi
Immunoferment va boshqa xohlagan immunokimyoviy tahlilda birinchi jarayon analiz qilinuvchining unga spetsifik bog’lanadigan antitelani “bilish” bosqichi hisoblanadi.
Shunday qilib immunokimyoviy komplekslar hosil qilish jarayoni affinnost bilan, komponentlar konsentratsiyalari va reaksiya sharoitlari bilan ta’minlangan qat’iy sanoq nisbatida bo’lib o’tadi, u holda analiz qilinuvchi bieikmaning dastlabki konsentratsiyasini aniqlash uchun hosil bo’ladigan immune komplaksning miqdoriy bahosi yetarli bo’ladi.
Antigenlarni analiz qilish paytida bunday baholashni o’tkazish uchun 2 ta yondashish mavjud:
1. Hosil bo’lgan immunokimyoviy komplekslar konsentratsiyasini to’g’ridan-to’g’ri o’lchash
2. Erkin qolgan ya’ni antitelolarning antigan bilan kompleks hosil qilish reaksiyasiga kirmaydigan konsentratsiyalarni aniqlash.
Ko’rinib turibdiki, bunday paytda immunokompleks hosil qilish miqdori qo’shilgan antitelolar umumiy miqdoning turlichaligi va erkin holda qolgan antitelolar miqdori bo’yicha aniqlanadi.
Antitelolar analizida bu yondashish analogik qoladi (aynan shunday qoladi), biroq 4.1 sxemada At va Ag o’rinlari simmetrik almashadi. Bunda yo kompleksining o’zi, yo antigen kompleksiga bog’lanmagan erkin holda qolganlari ham aniqlanadi.
Sxema – 4.1
Oddiy binary ko’mplek paydo qilishda kompanentlarning juda past konsentratsiyasida antigen-antitelo visual ham oddiy instrumental metodlar bilan ham registratsiya qilinishi mumkin emas, bu analitik sistemaning qiyinlashishiga (murakkabligiga) olib keladi.
Kompleks hosil qilishdagi vizualizatsiya yo’llaridan biri belgilangan birikmalardan foydalanish bo’ladi, ya’ni unda analiz qilinayotgan birikmalarning aniqlanayotgan konsentratsiyasi bilan solishtirilayotgan konsentratsiyasida belgi mumkin.
Qoidadagidek belgi tipidan analiz nomlari kelib chiqadi. Radioimmunologik analiz, flyurosen immunoanaliz, immunokofaktor analiz, immunoferment analiz.
Belgi sifatida immunoanalizda fermentlarni qo’llash imkoniyati ta’minlangan, avvalo, uning yuqori katalitik faolligi bilan substrat sistemalar muvofiq qo’llash bilan eritmada 10^-15 M undan past fermentlarni registratsiyalash.
Ikkinchi umumiy bosqichda har qanday IFA metodi belgilangan fermentning spetsifik kompleks yoki bog’lanishning erkin markazi bilan aloqa hosil qilishidir.
Ayrim sxemalarda (konkurent analiz) kompleksni belgilangan ferment bog’lanishi bilan hosil bo’lishi birinchi bosqich spetsifik antigenlarning antitelolarni bilish bosqichi bilan bir vaqtda o’tishi mumkin. Va nihoyat IFA da oxirgi kerakli, majburiy har xil fizik kimyoviy metodlar (spektrofotometrik-bunda substrat bilan germent reaksiyasini o’rkazish yo’li bilan erishiladi. flyurometrik, lyumisentnik va h.k.) bilan o’lchangan signal muvofiqligida belgi ferment transformatsiyasidir.
IFA ning barcha metodlarida maxsus immune kompleksda yoki erkin, bog’lanish markazi reaksiyasiga kirmaydigan kompleksda joylashgan belgilangan birikmaning fermentative faolligi o’lchanadi. Aynan shu prinsp IFA ning hamma metodlari klassifikatsiyasi asosida qo’yilgan bo’lishi mumkin.
IFA metodlarining birinchi guruhida (tip I, sxema 4,1) ferment belgi analiz qilinayotgan antigen va antitelaning hosil bo’layotgan spetsifik kompleksida joylashadi, shuning uchun aniqlanayotgan birikma konsentratsiyasining o’sishi (ko’payishi) hosil qilinayotgan spetsefik immunokimyoviy kompleksning ko’paytirilishi bilan, ayniqsa yuqori registratsiyalangan signal bilan kuzatib boriladi.
Shubhasiz, bunday vaqtda analiz qilinayotgan konsentratsiyaga bog’liq bo’lgan registratsiya signali taqdim qilinayotgan kalibrlashgrafigi (o’sayotgan) ko’payayotgan funksiyada tasvirlanishi kerak.
Metodlarning ikkinchi guruhida (tip II, sxema – 4,1) ferment belgi yordamida erkin qolgan bog’lanish markazlari paydo bo’ldi. Shuningdek kalibrlovchi (krivaya - qiyshiqlik) registratsiya signali tajriba qilinayotgan antigen konsentratsiyasini xarakterlovchi antigenning konsentratsiyasidan belgilangan darajagacha muvofiq bo’lgan maksimal darajadan pasayishini tasvirlaydi.
Kompleksning analiz qilinayotgan birikmasini yoki spetsefik bog’lanishning erkin qolgan joylarini “bilishning” birinchi jarayonida miqdoriy baholashni o’tkazish bir yoki bir necha bosqichda amalga oshiriladi.
Shunday qilib, analizning birinchi tipida spetsefik immun kompleksning hosil bo’lish miqdori bog’lanish markazidagi umumiy miqdordan bir muncha kam bo’lishi mumkin. Bunda faollikni o’lchash nol darajadan o’tkaziladi. (spetsefik bo’lmagan o’zaro bog’lanishlar bo’lmaganda). Tadqiqot qilinayotgan birikmaning maksimal sezgirligiga erishish uchun bog’lanish markazining keragidan ortiq bo’lishi kerak, shunda hosil bo’layotgan spetsifik kompleks konsentratsiyasi maksimal bo’ladi.
II tipdagi analizda birinchi bosqichda hosil bo’lgan immunokimyoviy komplekslar konsentratsiyasi spetsifik bog’lanish markazining boshlang’ich konsentratsiyasi turlari bo’yicha va spetsifik bog’lanish markazining erkin qolgan konsentratsiyasini ekstrimal o’lchash bo’yicha hisobiga olinadi.
… yetarlicha aniqlikga erishish uchun hosil bo’layotgan immune komplekslar miqdori spetsifik bog’lanish markazidagi erkin qolganlar miqdori bilan solishtirish kerak. Shunday qilib, analiz o’tkazishdagi bunday yondashish analizda qo’llaniladigan reagentlar konsentratsiyasining mosligi qanday bo’lsa, bog’lanish konstantiga va aniqlanayotgan birikma konsentratsiyasiga shunday sababni kuchaytirishga sabab (turtki) bo’ladi.
Ayrim paytlarda aniqlanayotgan birikma serob joylashganmi yoki bog’lanish markaziga munosabati bo’yicha yetarli emasmi, shunga asoslanib IFA metodlari klassifikatsiyasini adabiyotlarda ko’p uchratish mumkin.
Bunday yondashuv bir ma’noga ega emas, shunga ko’ra nafaqat reaksion sistemadagi komponentlar konsentratsiyalari orasidagi muvofiqlik, balki spetsifik immunokimyoviy kompleksning konsentratsiyalari va teng konstantali kompleks hosil qiluvchi limitrlovchi bo’ladi. Aytilganlarni misolda izohlaymiz.
Agar aniqlanayotgan antigen konsentratsiyasi [Ag]=10^-10M, qo’shilgan spetsifik antitelolar esa [At]=10^-8M, bunda konstantning barqarorligida, 10⁸M^-1, faqat 50% antigen (0,50x10^-10)immunokimyoviy kompleksda bog’langan bo’ladi. Komponentlarning teskari nisbatida ([Ag]=10^-8M, [At]=10^-10M) va shu konstantada kompleksning konsentratsiya barqarorligi shunday qoladi, uning to’g’ridan-to’g’ri aniqlashni ham shunday usulda olib boorish mumkin.Bunday klassifikatsiyalash analiz bir bir usulda olib borilishiga qaramay, uni maqsadga muvofiq bo’lmasa ham ikkita har xil tipga kiritamiz.
IFAning barcha metodlarining klassifikatsiyasi yuqorida izohlab berilganlarga muvofiq (belgilangan birikmalar bilan xohlagan immunokimyoviy analizning umumiyroq holida) bog’lanish markaziuni bevosita aniqlash [ tip I ] yoki bog’lanish joyining umumiy soni turlichaligi va bog’lanish markazida erkin qolganlar soni bo’yicha joylashishi [tip II sxema 4,1] bilan analiz qilinayotgan birikmaning spetsifik kompleks konsentratsiyasining bo’linishin qabul qilishimiz kerak.
IFA metodlari klassifikatsiyasi analizning birinchi bosqichida foydalaniladigan reagentlar turi bo’yicha ham amalga oshishi mumkin. Agar birinchi bosqichda sistemada faqat analiz qilinuvchi birikma va unga to’g’ri keladigan bog’lanish markazi (antigen va spetsifik antitelolar) qatnashayotgan bo’lsa, unda metod konkurentsiz bo’ladi.
I tipdagi konkurentsiz analiz uchun bog’lanish markazi konsentratsiyasi aniqlanayotgan birikma konsentratsiyasini oshirib yuboradigan komponentlar muvofiqligi optimal hisoblanadi. Haqiqatdan ham, bunday holda bog’lanish markazi konsentratsiyasining ko’tarilishida sistemadagi barqarorlik (sxema 4,1) immunokimyoviy kompleks hosil bo’lishi tomoniga qo’shilib ketadi, kompleks konsentratsiyasi o’sib ketadi, shubhasiz, kompleks bilan konsentratsiyani to’g’ri aniqlash eng yaxshi sezgirlik va aniqlik bilan amalga oshirish mumkin.
II tipdagi konkurentsiz analiz uchun spetsifik bog’lanish o’rni va aniqlanayotgan birikma (Ag) qiyosiy konsentratsiyasi yoki keragidan ortiq nisbatlarga rioya qilish kerakli sharoit hisoblanadi, bunda bog’lanish o’rni umumiy miqdorning ayirmachiligi va immun kompleks hosil qiluvchi miqdor aniqlanadi. Agar immun kompleks konsentratsiyasi bog’lanishning mumkin bo’lgan o’rnining umumiy miqdori bilan solishtirganda kam bo’lsa, u holda, u ikkita yaqin sonning ayirmachiligidek aniqlanadi. Ularning har biri aniq xato bilan joylashadi va shuning uchun yetarlicha aniqlikka erishilmaydi.
Agar analizning birinchi bosqichida sistemada bir vaqtda analiz qilinuvchi birikma va uning setsifik bog’lanishda yetishmovchilik tug’diruvchi konkurensiyaga olib keluvchi analogi ishtirok qilsa, u holda konkurentli metod hisoblanadi. Konkurent metodning analiz qilinayotgan birikma va uning analogining ______ konsentratsiyasiga munosabati bo’yicha spetsifik bog’lanish markazining yetishmovchiligi sharoiti kerak, aks holda immunokompleks hosil bo’lishning har bir jarayoni boshqasidan mustaqil bo’lib o’tadi. Bunda shubhasiz, belgining aniqlanayotgan eksperimental konsentratsiyasi eritmadagi analiz qilinayotgan birikma konsentratsiyasiga bog’liq bo’lmaydi.
IFA metodi klassifikatsiyasining keying (galdagi) prinspi reaksiyaning har bir immunokimyoviy bosqichida o’tkazilgan tipi bo’yicha ularning bo’linishi hisoblanadi. Shunga muvofiq bular bilan hamma metodlarni ikki guruhga 1) gomogenlar va 2) geterogenlarga ajratish mumkin.
Agar analizni bajarish vaqtida barcha reaksiyalar, fermentativ bosqichni ham hisoblaganda, eritmaga quyilsa, u holda metod gomogen hisoblanadi.
Bunda hosil bo’luvchi immunokimyoviy komplekslar kompleks reaksiyaga kirmaydigan erkin qolganlardan bo’linish bosqichi bo’lmaydi. Tadqiq qilinayotgan birikma konsentratsiyasi tadqiq qilinuvchi ligant yoki spetsifik bog’lanish markazi bilan kompleks hosil qilishda paydo bo’ladigan belgi, fermentning katalitik faolligining o’zgarish samarasiga asosan aniqlanadi.
Geterogen IFA analizi ikki fazali sistemada olib boriladigan metodlarni birlashtiradi. Bunda fazalarga bo’linish aniqlashning har qanday bosqichida bo’lib o’tishi mumkin. Geterogen metodlar har xil fazalarda joylashgan belgilangan birikmaning kompleks hosil qiluvchi va erkin qoluvchilarning bo’linishining majburiy bosqichlarini o’z ichiga oladi.
Belgilangan ferment birikmaning va spetsifik immunokompleksning qattiq fazasiga yaqinlashish effektiga asoslangan bo’linmaydigan geterogen metodlarga kiradigan ishlar ma’lum. Buni keyinchalik aniqlab ko’rib chiqamiz.
Geterogen metodlarga belgilangan reagentning immunokimyoviy kompleksida bog’langan va erkin qolganlar bo’linishi immobilizatsiyalanadigan reagent bilan qattiq faza yordamida va sistemaga qo’shimcha eritmalar komponentlari (tuzlar, polietilenglikol, spirt, ikkilamchi antitela, oqsil va boshqalar) kiritishdan hosil bo’lgan immunokomplekslar o’tirish yo’li bilan ham amalga oshadigan metodlar kiradi.
Biz bu barcha yondashishlarni ko’rib chiqishga to’xtalib o’tirmaymiz, balki belgilangan komponentlar bo’linishi uchun qattiq fazada unga qimirlamaydigan antitelo yoki antigenlar bilan qo’llaniladigan metodlar bilan chegaralanamiz. Hozirgi vaqtda ular juda keng tarqalgan.
Klassifikatsiyaning qulay bo’lishi maqsadida geterogen metodlarning bo’linishi butun analizni aniqlovchi hisoblanadigan “bilish”ning birinchi bosqichini o’tkazadigan xarakteri bo’yicha maqsadga muvofiq o’tkazish.
Agar birinchi bosqichda antigen yoki antitela immobilizatsiyalangan holatda qo’llaniladi, shubhasiz, spetsifik immunokompleks shakllanishi qattiq fazada o’tadi. Bu esa qattiq fazali metodga kiradi.
Agar analizning birinchi bosqichida spetsifik immune komplekslar hosil bo’lishi eritmada o’tkazilsa, undan keyingina bo’lish maqsadida immobilizatsiya reagent bilan qattiq faza qo’llaniladi. Bunday metodlarni gomogeno-geterogenlar deb klassifikatsiyalash maqsadga muvofiq.
Shunday qilib IFA metodlari klassifikatsiyasini ___-sxemadagidek tasavvur qilish mumkin. Bunda II tipdagi analizning kattaroq xilma-xilligi va I tipdagi gomogeno-geterogen metodlar va konkurentlik yo’qligi kuzatiladi.
Jadval
Bugungi kunda reagentlar qo’llanilishining xarakteri bo’yicha va ayrim bosqichlarning ketme-ketligi bilan farqlanadigan IFA ning turli xil metodlari o’ttizdan ortiq variantlari ishlab chiqilgan. Analiz variantlarining bunday ko’pligi gomogen metodlarda fermentative faollik modulyatsiyasining turli xil usullarida va IFAning geterogen immobilizatsiya reagent tashuvchilar (antigen va antitana) va belgilangan fermentlar bilan turli xil kombinatsiyalarni qo’llash bilan ta’minlangan. Bu barcha metodlar yuqorida keltirib o’tilgan sistemaga muvofiq klassifikatsiyalanishi mumkin.
Geterogen va gomogen analizning taniqli metodlarining mukammal klassifikatsiyasi ___-sxemasini hisobga olgan holda va analizda belgilangan ferment reagentlar antitelalar, antigenlar va ikkilamchi antitelalar ishlatiladigan tipda amalga oshirish mumkin.
Analizning ayrim bosqichlarini o’tkazishning ketma-ketligidagi xilma-xilligini hisobga olib, IFA gomogen va geterogenida antigen va antitelalarni aniqlash metodlarining ayrimlarini ko’rib chiqish maqsadga muvofiq bo’ladi.