Практикум по молекулярной генетике учебно-методическое пособие

 
3.1 Определение концентрации нуклеиновых кислот 
Для многих методик манипуляции с ДНК (ПЦР, рестрикция, лигирование) 
необходимо знать ее концентрацию. Довольно часто количественную и 
качественную оценку препарату выделенной ДНК можно оценить при гель-
электрофорезе, следующим, как правило, сразу за процедурой выделения. Для 
этого визуально сравнивают на соседних дорожках геля интенсивность 
свечения в ультрафиолете полученного образца с образцом известной 
концентрации (с маркерами молекулярной массы, концентрация которых 
указывается в описании). Определить концентрацию ДНК, а также степень ее 
чистоты, можно с помощью спектрофотометра, что точнее и быстрее. Для этого 
измеряют оптическую плотность раствора ДНК при длине волны 260 нм.
Нуклеиновые кислоты (НК) поглощают УФ излучение в области 240–290 
нм с максимумом при 260 нм. Хромофорами служат азотистые основания 
нуклеиновых кислот, особенно пиримидиновые. Пиримидины поглощают УФ 
свет примерно в 10–20 раз интенсивнее, чем хромофоры белковых молекул – 
триптофан, тирозин и фенилаланин имеющих максимум поглощения при 280 
нм. Для чистых образцов ДНК соотношение оптических плотностей 
полученных при измерении 260 нм и 280 нм должно быть более 1,8.
Оптическая плотность раствора нуклеиновых кислот при длине волны 260 
нм, равная 1, соответствует 50 мкг/мл двухцепочечных ДНК и РНК, 40 мкг/мл 
одноцепочечных ДНК и РНК и 20 мкг/мл олигонуклеотидов. По известной 
оптической плотности раствора можно рассчитать концентрацию, мкг/мкл, по 
соответствующим формулам: 
для двух цепей полинуклеотидов: ΔА260 х разбавление х 0.05; 
для одиночных цепей ДНК: ΔА260 х разбавление х 0.037; 
для одиночных цепей РНК: ΔА260 х разбавление х 0.04; 
для олигонуклеотидов: ΔА260 х разбавление х 0.02, 
где ΔА260 - разница оптических плотностей раствора нуклеиновых кислот 
и 
растворителя, 
которым 
практически 
всегда 
является 
стерильная 
деионизованная вода.