Практикум по молекулярной генетике учебно-методическое пособие

ГЛАВА 1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК 
 
Процедура выделения ДНК из клеток и тканей часто является исходным 
(основным) этапом в исследовании живого организма на молекулярном уровне. 
При наличии выделенной ДНК, далее становятся возможными ее амплификация 
(с 
помощью 
полимеразной 
цепной 
реакции 
– 
ПЦР), 
определение 
последовательности (секвенирование), рестрикционный анализ, клонирование, 
гибридизация.
Все живые организмы делятся на про- и эукариот. В клетках бактерий, 
как правило, существует одна кольцевая хромосома размером от 0.4 до 
нескольких десятков миллионов пар оснований, упаковка которой достигается 
за счет суперскрученности. Дополнительно к ней в бактериях встречаются 
небольшие кольцевые молекулы ДНК – плазмиды. Количество их копий может 
варьировать от 1 (низкокопийные) до нескольких тысяч (мультикопийные) на 
клетку. У эукариот геном представлен несколькими линейными молекулами 
ДНК, которые упаковываются с помощью гистоновых белков. 
В общем случае, для выделения ДНК клетку необходимо разрушить тем 
или иным способом, а ДНК очистить от других клеточных компонентов. В 
случае эукариот, нужно отделить ДНК от белков, входящих в состав 
нуклеопротеидных комплексов хроматина. При этом важно защитить ДНК от 
действия нуклеаз и максимально сохранить еѐ целостность, поскольку длинные 
линейные молекулы ДНК при их изоляции из клетки неизбежно 
фрагментируются.
Методы выделения ДНК обычно включают следующие этапы: 1) лизис 
клеток 
(или 
разрушение 
физическим, 
механическим 
способом); 
2) 
ферментативное разрушение белков протеиназами и/или депротеинизацию 
клеточного лизата с помощью фенола и хлороформа; 3) центрифугирование для 
удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл. Затем 
ДНК осаждают из раствора этанолом и после центрифугирования растворяют 
осадок в буферном растворе. Вместе с ДНК частично выделяется и РНК, от 
которой избавляются с помощью фермента РНКазы.
Для лизиса клеток и денатурации белков часто используется детергент 
додецилсульфат натрия или хаотропный агент гуанидинизотиоцианат. Если нет 
необходимости в длинных целых фрагментах ДНК, клетки можно разрушить 
механическим способом путем перетирания со стеклом или речным песком в 
жидком азоте. Ряд современных методов предусматривает сорбцию ДНК на 
гранулах силикагеля в присутствии хаотропных веществ, центрифугирование и 
последующую элюцию ДНК с гранул в раствор. Некоторые фирмы продают 
наборы реактивов для выделения ДНК с использованием магнитных частиц, 
покрытых силикой SiO
2
. Некоторые коммерческие наборы предусматривают 

---

6 
сорбцию ДНК на мембранах или ионообменных сорбентах. Фенол-
хлороформный метод экстракции ДНК считается стандартным.