П. И. Гунькова общая и пищевая микробиология часть I учебное пособие

1.3. 
Методы микроскопии 
 
Структуру объекта можно различить, если его части,
во-первых, по-разному отражают и поглощают свет, или, во-вторых, 
отличаются одна от другой (или от среды) показателями преломле-
ния. Эти свойства обусловливают разницу амплитуд фаз световых 
волн, отраженных или прошедших через разные участки объекта,
отчего зависит четкость изображения. В связи с этим в зависимости 
от характера и свойств исследуемого объекта выбираются методы 
наблюдения в оптической микроскопии.
Метод светлого поля в проходящем свете 
применяется при 
исследовании прозрачных объектов (например, тонкие окрашенные 
срезы животных и растительных тканей). 
Метод светлого поля в отраженном свете 
применяется для 
наблюдения непрозрачных объектов (например, шлифов металлов). 

---

13
Структура объекта видна из-за различия в отражающей способности 
еѐ элементов: на светлом поле выделяются неоднородности, рассеи-
вающие падающий на них свет. 
Метод темного поля в проходящем свете 
применяется для 
рассмотрения прозрачных неадсорбирующих объектов, например, 
для наблюдения за подвижностью живых клеток микроорганизмов,
обнаружения возбудителей некоторых болезней (лептоспироза).
Темнопольная микроскопия основана на освещении объекта косыми 
лучами света, которые не попадают в объектив и остаются невиди-
мыми для глаза (явление Тиндаля). Поэтому поле зрения выглядит 
совершенно черным. Если препарат содержит какие-либо частицы, 
например, микроорганизмы, то косые лучи, направленные под опре-
деленным углом, вследствие дифракции отражаются от их поверхно-
сти и настолько отклоняются от своего начального направления, что 
попадают в объектив. Поскольку лучи света идут именно от объекта, 
то наблюдатель видит на черном фоне характерное светящееся изо-
бражение контуров микробных клеток или других частиц. 
Метод темного поля в отраженном свете. 
Для получения 
изображения непрозрачного объекта его освещают сверху с помощью 
специальной кольцевой зеркальной системы, расположенной вокруг 
объектива и называемой эпиконденсором. Изображение создается 
только лучами, рассеянными объектом, тогда как лучи света, отра-
зившиеся от поверхности, в объектив не попадают. 
Метод наблюдения в поляризованном свете 
применяется для 
исследования анизотропных объектов, т. е. объектов, у которых
оптические свойства неодинаковы по различным направлениям (на-
пример, некоторые растительные и животные ткани). Световая волна 
в анизотропной среде распадается на две волны с взаимно перпенди-
кулярными плоскостями колебаний электромагнитных волн, которые 
распространяются с различной скоростью. Эти плоскости называют 
плоскостями поляризации. Угол поворота плоскости поляризации 
прямо пропорционален длине пути и находится в зависимости от ро-
да среды, в которой распространяется свет. 
Для создания эффекта поляризации в поляризационных мик-
роскопах имеются два поляризационных фильтра, один из которых 
помещается между источником освещения и объектом – поляриза-
тор, а второй находится в тубусе между объективом и окуляром – 
анализатор. Если главные оси поляризации скрещены, то в микро-

---

14
скопе видны только те фрагменты биологического объекта, которые 
вращают плоскость поляризации, при этом яркость наблюдаемых 
фрагментов тем выше, чем больше угол поворота плоскости поляри-
зации. 
Методы поляризационной микроскопии получили наибольшее 
распространение в минералогии, кристаллографии, при изучении 
биологических объектов.
Метод фазово-контрастной микроскопии 
используется при 
исследовании прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при 
светопольной микроскопии (например, неокрашенные животные и 
растительные ткани, различные микроорганизмы). Метод фазового 
контраста основан на том, что фазовая скорость света обратно про-
порциональна показателю преломления. Фаза луча, проходящего че-
рез объект с более высоким показателем преломления, чем у окру-
жающей среды, будет запаздывать по сравнению с фазой того луча, 
который проходит только через среду. В фазово-контрастном микро-
скопе специальный конденсор и особо устроенный объектив регули-
руют изменения фазы световых волн и превращают разность фаз в 
разность интенсивностей света, благодаря чему детали строения объ-
екта становятся видимыми для глаза. 
Для проведения исследований с использованием данного мето-
да в дополнение к световому микроскопу следует иметь фазово-
контрастное устройство. Наиболее широко применяется модель
КФ-4, состоящая из вспомогательного микроскопа, специальных фа-
зовых объективов и конденсора с набором кольцевых диафрагм, каж-
дая из которых соответствует фазовой пластинке определенного объ-
ектива.
Вспомогательный микроскоп устанавливают, заменяя окуляр 
обычного микроскопа.
Для получения фазового контраста в объектив вводится специ-
альная фазовая пластинка, которая представляет собой тонкий диск 
напыления из солей редких металлов на одну из внутренних линз 
объектива. Она изменяет фазу проходящей световой волны на 1/4 λ, 
что приводит к превращению фазовых различий в амплитудные. 
Кольцевые диафрагмы установлены в револьверном диске под кон-
денсором и поворотом диска могут быстро меняться. Кольцевая диа-
фрагма пропускает через конденсор в плоскость препарата лишь 
кольцо света. Эффект фазового контраста получают путем точного 

---

15
совмещения кольца фазовой пластинки с проекцией кольцевой диа-
фрагмы. 
Метод люминесцентной микроскопии. 
Применение люминес-
центной микроскопии основано на свойстве некоторых биологиче-
ских объектов светиться при облучении их невидимыми для челове-
ческого глаза коротковолновыми лучами (сине-фиолетовыми с дли-
ной волны около 460 нм или ультрафиолетовыми с длиной волны 
300 – 400 нм). Это связано с тем, что, поглощая разные виды энергии 
(световую, электрическую), атомы некоторых веществ переходят
в возбужденное состояние, а затем, возвращаясь в исходное состоя-
ние, выделяют поглощенную энергию в виде светового излучения. 
Люминесцентное свечение подчиняется закону Стокса, согласно ко-
торому свет люминесценции имеет большую длину волны, чем свет 
возбуждения. Отдельные молекулы вещества могут на короткое вре-
мя поглощать свет, а затем испускать его, но с другой длиной волны, 
превышая длину волны поглощаемого света возбуждения
на 20 – 50 нм. Например, если объект поглощает синий свет, то све-
тится зеленым, если зеленый – желтым, если желтый – красно-
оранжевым. Это собственная, или первичная, люминесценция.
Первичным свечением обладают клетки растений и водорослей 
благодаря наличию хлорофилла, а также некоторые бактерии, выра-
батывающие пигмент. Большинство клеток микроорганизмов облада-
ет слабой первичной люминесценцией.
Вторичная (или наведенная) люминесценция объектов, не обла-
дающих собственной люминесценцией, достигается обработкой их 
специальными красителями – флуорохромами. Наиболее широко ис-
пользуются флуорохромы акридиновой и тиазоловой групп (акридин 
оранжевый и желтый, аурамин, уранин, родамин, тиофлавин, приму-
лин, флуоресцин и др.). В частности, акридин оранжевый окрашивает 
цитоплазму в зелено-желтый, метахроматин – в ярко-красный, вакуо-
ли – в розовый, ядро – в светло-зеленый цвет. 
В качестве источника ультрафиолетового излучения в люми-
несцентных микроскопах используются специальные кварцевые лам-
пы. Прежде чем попасть на объект, лучи лампы проходят через ряд 
светофильтров, пропускающих только определенную часть ультра-
фиолетового спектра с λ = 360 – 380 нм. 
Более доступным способом возбудителя люминесценции явля-
ется использование коротковолновой части видимого света – сине-

---

16
фиолетовых лучей с λ = 460 нм. В этом случае наблюдения можно 
проводить не только в специальном люминесцентном микроскопе, но 
и с помощью обычного микроскопа, установив на пути лучей синий 
стеклянный или жидкий светофильтр. Излишние синие лучи убирают 
желтым светофильтром, который помещают на окуляр микроскопа.
В результате в препарате на черном фоне видны люминесцирующие 
объекты.
Люминесцентная микроскопия позволяет наблюдать морфоло-
гические особенности объектов, которые при обычной микроскопии 
лежат за пределами видимости. Кроме того, она дает возможность 
дифференциации вида микробов по характеру свечения, изучения 
изменения структур при различных физиологических состояниях 
клетки. Этот метод позволяет изучать антигенную структуру бакте-
рий и обнаруживать возбудителей инфекционных заболеваний путем 
применения меченных люминесцентными красками иммунных сыво-
роток. 
Люминесцентная микроскопия осуществляется в затемненной 
комнате с помощью специального люминесцентного микроскопа, на-
пример, МЛ-2.