Oʻzbekiston respublikasi oliy va oʻrta maxsus taʼlim vazirligi mirzo ulugʻbek nomidagi oʻzbekiston milliy universitetining jizzax filiali hujayra muhandisligi fanidan laboratotiya mashg’ulotlarini bajarish bo”yicha

10-MAVZU: O‘SIMLIK HUJAYRASIDAN RNK AJRATISH
O‘simlik hujayrasidan RNK ajratish.


Material va asbob uskunalar. 5 g barg, suyuq azot, havoncha, 2 ta 250 ml kolba, 100 ml stakan, 1 m doka, stol sentrifugasi, sentrifuga probirkalari, magnitli aralashtirgich, rezina nokchaga ulangan pipetka, muzlatgich, muz hammomi va spektrofotometr.
1. 5 g o‘simlik materiali suyuq azot yordamida muzlatiladi va havonchada kukun holiga keltiriladi va 250 ml li tagi yumaloq kolbaga solinadi.
2. 50 ml bufer G solinadi va aralashtirib, 4 qavat dokadan o‘tkaziladi. 8000 ayl/daq. tezlikda 10 daqiqa -4⁰ S da sentrifugalanadi.
3. Ustki suyuq qismi olinib 1/20 hajmi 10% li SDS (oxirgi konsentratsiyasi 0,5%) solinadi.
4. Teng miqdorda suv bilan to‘yintirilgan fenol, teng miqdorda xloroform, izoamil spirti aralashmasi (24:1) solinadi va magnitli aralashtirgichda 20 daqiqa xona haroratida aralashtiriladi. So‘ng sentrifuga probirkalariga solib stol sentrifugasigada 2500 g da 10 daqiqa davomida sentrifugalanadi. Denaturatsiyaga uchragan oqsillar organik suyuqlik va suv qavatlari o‘rtasida interfaza hosil qiladi.
5. Ustki suyuq qismi va interfaza rezina nokga ulangan pipetka yordamida 250 ml kolbaga tortib olinadi va teng miqdorda xloroform solib 10 daqiqa davomida aralashtiriladi.
6. Sentrifugalanib fazalarga ajratiladi va ustki suyuq qismi toza 100 ml li stakanga olinib, 1/20 hajm 3M natriy atsetat va 2 hajm etanol solib -20⁰ S haroratda kecha davomida nuklein kislotalar cho‘ktiriladi.
7. Sentrifugalanib cho‘kma -4⁰ S da ikki marta 1-2 ml rN 6, 0,3 M natriy atsetat bilan yuviladi (etanol va DNK dan tozalash uchun).
8. CHo‘kma ikki marta tarkibida 0,1 M kaliy atsetat bo‘lgan 80% li etanol bilan yuviladi va shu eritmada -20⁰ S da saqlanadi. RNK ning miqdorini cho‘kmani oldindan quritib, distillangan suvda eritib spektrofotometrda aniqlash mumkin. Olingan eritmaning optik zichligini 260 nm (1 03₂₆₀=40 mkg/ml²) o‘lchanadi. Preparatning tozaligini baholash uchun UF nurlarining yutilishi spektri o‘lchanadi: toza RNK uchun - 03₂₆₀:03₂₆₀=2,0 bo‘lishi kerak.