Oʻzbekiston respublikasi oliy va oʻrta maxsus taʼlim vazirligi mirzo ulugʻbek nomidagi oʻzbekiston milliy universitetining jizzax filiali hujayra muhandisligi fanidan laboratotiya mashg’ulotlarini bajarish bo”yicha

Bufer eritmalar va reaktivlar:
Bufer G: 0,2 M tris HCl rN 8,5; 0,2 M saxaroza; 30 mM magniy atsetat; 60 mM KCl. Eritmalar avtoklavda sterillanib suyuq holda yoki -20⁰ S da muzlatib saqlanadi. Ishlatishdan oldin 1% gacha polivinilpirolidon va 0,31% gacha 2 merkapoetanol qo‘shiladi.
Xloroform: izoamil spirti (24:1), suvda to‘yintirilgan fenol, 3 M natriy atsetat, 0,1 M kaliy atsetat.
Adabiyot

1. 
   Klonirovanie DNK. Metodы. Moskva, Mir. 1988.
   

11- MAVZU: PROTOPLASTLARNI OLISH USULI
Zamburug‘ protoplastlarini olish va ularni qo‘shilishi.


I.I. Protoplastlarni olish usuli.
“Protoplast” deganda faol metabolizm va energiya almashish qobilyatiga ega bo‘lgan, hujayra qobig‘i ichida joylashgan, hujayrani bir qismini tushinish mumkin. Protoalastlarni ajratib olish usullari rivojlangan sari tadqiqotchilar protoplastlar deb mikrob hujayrasi parchalanganda hosil bo‘ladigan yarim o‘tkazgich xususiyatiga ega bo‘lgan sitoplazma membranasini ataydigan bo‘ldilar. Uzoq vaqtlargacha protoplastlar asosan sitologik izlanishning manbai sifatida qaralar edi. Hozirgi paytda protoplastlar yordamida olingan mikroorganizmlarni qimmatli duragay shtammlarini sanoat miqyosida keng qo‘llanilmoqda. Protoplastlarni qo‘shish usuli mikroorganizmlarni genetik seleksion jarayonlarini atroflicha o‘rganib, hujayralardan normal jinsiy usul bilan duragay olish mumkin bo‘lmaganda, protoplastlar yordamida turlararo duragay olish mumkinligini taqoza qiladi.


Protoplast asosan 3 usulda olinadi.
1. Mexanik usul
2. Hujayra devorlaridagi komponentlarni spetsifik sintezi.
3. Litik fermentlar ta’sirida hujayra devorlarini parchalash.

1. Mexanik usul bilan protoplast olish asosan kam samarali bo‘lgani uchun deyarli qo‘llanilmaydi.

2. Hujayra devorlaridagi komponentlarni spetsifik sintezi esa spetsifik ingibitorlarni tanlab hujayra devoriga ta’sir qilib sitoplazmatik komponentlarga zarar etkazmaydi.
3. Protoplastlarni bakteriya hujayralaridan litik fermentlar yordamida ajratib olishda har xil litik fermentlardan asosan lizotsimdan foydalaniladi. Zamburug‘lardan protoplast olish uchun tok shilliq qurti oshqozonidan ajratib olingan xitinaza fermentidan foydalaniladi.
Hozirgi paytda bir qator mikroorganizmlardan litik fermentlar ajratib olish yo‘lga qo‘yilgan. Bular jumlasiga Streptomeces, Arthrobacter luteus, Bacillus circulans, Trichoderma harzianum va Actinomyces cinerosus lar kiradi.
SHuning uchun mikropreparatlardan istagancha proplast ajratib olish imkoniyati mavjuddir. Protoplast olishda litik fermentlardan tashqari osmotik stabilizatorlar ham katta vazifani bajaradi. Hujayra devorlaridagi osmotik to‘siq protoplastlarda tabiiy muhofazani yzqotganligi tufayli osmotik ta’sirga sezgir bo‘lib qoladi.
Stabilizatorsiz oziqada hujayrani o‘rab turuvchi nozik sitoplazmatik membrana ferment ta’sirida tez parchalanadi. Protoplastlarni yorilishini oldini olish maqsadida litik birikmaga har xil moddalar qo‘shiladi, bu moddalar suyuqlikdagi osmotik bosimni hujayra ichidagi suyuqlik bosimga tenglashtiradi, shuning bilan birga stabil jarayonni ta’minlaydi. Stabilizator vazifasini o‘tovchi moddalarning miqdori samarasiga katta ta’sir ko‘rsatadi. Stabilizator sifatida qand, ko‘p atomli spirtlar, neorganik birikmalar, mannit, sorbit, raminoza, maltoza, saxaroza, KCl₂, MgCl_2, NaCl_2, NM₄Cl_2, MgSO_4,va boshqalar ishlatiladi. Stabilizatorning miqdori zamburug‘larning turlariga qarab 0,4 dan 2,0 M gacha bo‘lishi mumkin. Stabilizatorlarni miqdori to‘g‘ri tanlansa litik fermentning ta’siri kuchayadi. Protoplastlar olish imkoniyati samarali kechadi. Protoplast olish uchun suyuq boy oziqada zamburug‘ tayyorlanadi. Boy oziqaning tarkibi – CHapek oziqasi, pepton-10g/l, achitqi atolizati-1g/l. Mikroorganizmlar 16-18 soat davomida 30⁰ S haroratda chayqatish usuli bilan o‘stiriladi. SHuning bilan birga mikroorganizmlar suyuq oziqada chayqatgichda kechqurundan mashg‘ulot o‘tkazgungacha o‘stiriladi.
Mashg‘ulotlar o‘tkazish uchun quyidagi ishlar bajariladi:
1. Otalik va onalik kulturalarning konidiyalaridan suspenziya tayyorlanadi (rangli yoki auksotrof mutantlar).
2. Buning uchun platina yoki po‘lat simdan yaslgan ilmoq bilan agarli oziqadagi kultura sterillangan suvli probirkaga solinadi. Olingan suvli probirkada hosil bo‘lgan suspenziyani chayqatib steril dokadan o‘tkazish kerak.