Oʻzbekiston respublikasi oliy va oʻrta maxsus taʼlim vazirligi mirzo ulugʻbek nomidagi oʻzbekiston milliy universitetining jizzax filiali hujayra muhandisligi fanidan laboratotiya mashg’ulotlarini bajarish bo”yicha

Bakteriyalardan ishqor yordamida plazmid DNK sini ajratish.
(Birnboym-Dolining modifikatsiyalangan usuli)

Bakteriyalarda hujayra xromosoma DNK sidan tashqari xalqasimon tuzilishga ega bo‘lgan DNK molekulalari bo‘lib ular plazmidlar deyiladi. Plazmidlar tarkibida zaxarli moddalarga va antibiotiklarga chidamli gen mavjud. Ular mustaqil ravishda replikatsiyalana oladi. SHu xususiyati tufayli plazmidlardan gen muhandisligida vektor sifatida foydalanish mumkin. Plazmidlarni ajratish asosan 3 ta bosqichdan iborat.

1. Bakteriya hujayralarini parchalash (lizis qilish)
2. Plazmid DNK sini xromosoma DNK sidan ajratish
3. Plazmid DNK sini hujayra RNK sidan va oqsillardan tozalash


Material va asbob uskunalar. Essherichia coli bakteriyasi kloni, LV oziqa muhiti, I-eritma (50 mM saxoroza, 25 mM tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0), II-eritma (0,2 NaOH, 1% SDS), 5 M kaliy atsetat rN 4,8 (60 ml 5 M kaliy atsetat tayyorlash uchun 11,5 ml sirka kislotasi, 28,5 ml distillangan suv), 1 ml 96% li etil spirti, TE-bufer muzlatgich, stol sentrifugasi, 4 ta eppendorf probirkalari, sterill shisha tayoqcha, parafilm, filtr qog‘ozi va 1 ml li avtomat pipetka.
Ishning borishi.
1. Tanlangan koloniyani mikrobiologik sirtmoq yordamida 3 ml LV oziqa muhiti va antibiotikli probirkaga solinadi va kecha davomida 37⁰ S temperaturada o‘stiriladi (bu tungi kultura deyiladi).
2. 1,5 ml tungi kulturani eppendorf probirkasiga solinadi va stol sentrifugasida 15 daqiqa 5000 ayl/daq. aylantiriladi.
3. CHo‘kmaga 100 mkl (mikrolitr) I-eritma solinadi va aralashtiriladi.
4. Tezda 2000 mkl II-eritma solinadi va 5 daqiqa yaxshilab aralashtirilgandan so‘ng muz hammomida 15 daqiqa saqlanadi. Bunda suspenziyaning rangi oqarib shilimshiq holiga kelishi kerak.
5. Ustiga sovitilgan 150 mkl 3 M natriy atsetat (rN 4,8-5,0) solinadi va yaxshilab aralashtiriladi, bunda oq cho‘kma tusha boshlaydi (oqsil va xromosoma DNK si). 5 daqiqa 5000 ayl/daq. sentrifugalanadi.
6. CHo‘kma steril shisha tayoqcha yordamida olib tashlanadi va suyuq qismiga 1 ml 96% li etil spirti solinadi va plazmid DNK si cho‘kmaga yaxshi tushishi uchun sovutgichga qo‘yiladi.
7. 2 soatdan so‘ng 3 min. davomida 3000 ayl/daq. sentrifugalanadi. CHo‘kma xona haroratida quritilib 150 mkl TE buferida eritiladi va plazmid DNK si elektroforez yordamida tekshiriladi.

Adabiyotlar

1. C.F. Brunk, V.Leick. Rapid equtibrium isopicnic CsCl gradients. Biochem. biophus. Acta.
1969. vol. 179. p. 136-144.
2. M.M. Babukin, V.V. Zinchcnko. Rapid separation of DNA s by buoyant bonsity in three-layer
CsC gradients. –Anal. Biochemistry, 1984, vol. 137, p.175-181.