Oʻzbekiston respublikasi oliy va oʻrta maxsus taʼlim vazirligi mirzo ulugʻbek nomidagi oʻzbekiston milliy universitetining jizzax filiali hujayra muhandisligi fanidan laboratotiya mashg’ulotlarini bajarish bo”yicha

6-MAVZU: PLAZMID DNKSINING RESTRIKSION TAHLIL
Plazmid DNK sini restriksion tahlili.


1 – ish: Plazmid DNK si molekulasini restriksion endonukleazalar
bilan bo‘laklarga bo‘lish.


Material va asbob uskunalar. Guruhda: 37⁰ S va 65⁰ S haroratli termostat, hammom, muz hammomi, 0,7 g agaroza, 0,5 l elektroforez buferi, 0,5 ml U-buferi, 0,5 ml ligaza buferi, II-tip restriktazalari, elektroforez apparati, doimiy tok manbai, Eppendorf probirkalari, aralashtirgich.
Iikita student uchun: 20 mkl li avtomat pipetka, 2 ta Eppendorf probirkasi, 0,5 ml steril distillangan suv. Agrobakteriy o‘sishi uchun oziqa muhiti.
Tushuntirish. Molekulyar klonlashda restriksiya endonukleazalari (II-tip restriktazalari) dan foydalaniladi, bular qo‘sh zanjirli DNK nukleotidlari ketma-ketligi, tanish (bilish) 4-6 nukleotiddan iborat bo‘lgan ikkinchi tartibdagi simmetriya o‘qiga ega bo‘lgan saytlardan qirqadi. Agar restriktaza simmetriya o‘qi bo‘lab emas balki bir necha nukleotid naridan uzsa “yopishqoq” uchli bo‘laklar hosil bo‘ladi. Har xil DNK bo‘laklarining bunday “yopishqoq” uchlari bir-birlariga mos ravishda birlashadi. Restriktazalar agar simmetriya o‘qidan uzsa “to‘mtoq” uchli bo‘laklar hosil qiladi. Har bir restriktaza ma’lum bir qulay sharoitda o‘z faolligini namoyon qiladi. Bunga harorat, rN, reaksiya aralashmalarining ion kuchi kiradi. Bular haqida to‘liq ma’lumotni Maniatis va boshqalarning “Molekulyarnoe klonirovanie” kitobidan olish mumkin. DNK bo‘laklarining “yopishqoq” uchlari komplementar (mos) asoslari o‘zaro vodorod bog‘lari hosil bo‘lishi hisobiga juftlashadi. Bunday juftlashishlarning samarasi “yopishqoq” uchlarning eritmadagi miqdoriga va eritmaning temperaturasiga bog‘liq. SHuning uchun biror DNK bo‘lagini vektor orqali klonlashda vetor miqdoriga nisbatan klonlanadigan bo‘laklarning miqdori ancha ko‘p bo‘lishi kerak (vektor va DNK bo‘laklari nisbati 1:2 dan 1:10 gacha).
“YOpishqoq” uchlar o‘zaro juftlashganida DNK ligaza fermenti yordamida kovalent bog‘ hosil qiladi (ligirlash reaksiyasi). Buning uchun asosan T fagdan olingan DNK ligaza fermentidan foydalaniladi. DNK bo‘laklarining “to‘mtoq” uchlari ham T fagi DNK ligazasi yordamida birlashadi. Tasodifan uchrashganda bunday bo‘laklar o‘rtasida yangi vodorod bog‘lari hosil bo‘lmaydi, birlashish samarasi “to‘mtoq” uchlarning eritmadagi miqdoriga bog‘liq. T fagi DNK ligazasi yuzaga keltiradigan reaksiya ATF qo‘shilganda samarali kechadi.