2.3. Jigar mitoxondriyalarini nafas olishi va oksidlanishli fosforlanishini
aniqlash
Mitoxondriyalarning
nafas
olishi
va
oksidlanishli
fosforlanishi
polyarografiya usuli bilan aniqlandi [Almatov K.T., Axmerov R.N., Zaripov B.Z.,
Irgashev M.S., Allamuratov Sh.I., 1993 b]. Buning uchun polyarografiya
idishchasiga ―yacheyka‖ 1 ml o’lchash muhiti (saharoza 250mM, Kcl 50mM,
KH2PO
4
5mM, pH 7,4) quyilib, ustiga oksidlanish substratlaridan biri (10mM dan
suksinat, yoki α-ketoglutarat) qo’shiladi. Polyarograf ishga tushiriladi, polyarograf
39
perosi to’g’ri chiziq bo’ylab yoza boshlaydi. Undan keyin polyarografiya
yacheykasiga mitoxondriya (0,05-0,06ml; 3-4mg oqsilli) qo’shiladi. Mitoxondriya
nafas ola boshlaydi (V
2
holat), ya’ni mitoxondriya o’lchash muhitidagi kislorodni
iste’mol qila boshlaydi, buni polyarograf perosi yoza boshlaydi, oradan 30-40
soniya o’tishi bilan polyarografiya yacheykasiga 150-200mkM ADF solindi,
natijada birdaniga mitoxondriyaning nafas olishi keskin tezlashib ketdi (V
3
holat).
Bu mitoxondriyaga qo’shilgan ADF o’lchash muhitidagi F
n
bilan qo’shilib ATF
hosil bo’lishi boshlanganligini bildiradi va buni oksidlanishli fosforlanishli holat
deb ataladi. Qo’shilgan ADF ning hammasi ATF ga aylanib bo’lgandan keyin
mitoxondriyaning nafas olishi keskin sekinlashdi. Buni (V
4
holat) tinchlik, ya’ni
ishlab bo’lgandan keyingi dam olish holati deb ataladi. Demak, mitoxondriyaning
nafas olishi ADF qo’shilganda qancha tez bo’lsa, o’shancha ko’p ATF
sintezlanadi, chunki nafas olish koeffitsienti V
3
/V
4
ga nisbati bilan belgilanadi.
Mitoxondriyaning nafas olish koeffitsienti Chans uslubi bilan (NK
CH
) aniqlandi.
(V
3
/V
4
) [Shance B, Williams G.R., 1955]. Undan tashqari, mitoxondriyaning
ATFni sintezlash faoliyatini baholashda ADF/O (R/O) koeffitsientidan ham
foydalaniladi. Bunda mitoxondriyaga qo’shilgan ADF ning barchasi to’la ATF
sintezlangan paytida sarflangan kislorodning miqdoriga nisbati o’lchanadi. Bu
nisbat qancha katta bo’lsa mitoxondriyaning energiya ishlab chiqarishi
o’shanchalik yuqori bo’ladi. Nazariy tomondan mitoxondriyada suksinatni
oksidlanishda 2 ta, NAD ga bog’liq substratlarning oksidlanishida 3 ta molekula
ATF hosil bo’ladi. Amalda, yaxshi holatda ajratib olingan mitoxondriyalarda
ADF/O suksinat oksidlanishida ikkiga, NADga bog’liq substratlarning
oksidlanishida uch mol ATF hosil bo’ladi.
Yacheykaga oksidlanishni fosforlanishdan ayiruvchi 2.4-dinitrofenol
qo’shilsa mitoxondriyaning nafas olishi keskin tezlashib ketadi va tugaguncha
davom etadi. Buni erkin oksidlanish deb ataladi. Yacheykaga qo’shilgan 2,4-
dinitrofenol miqdori 5.10
-5
M ni tashkil qiladi.
Mitoxondriyalarning nafas olish tezligi, nanogramm atom kislorod/daqiqa
mg oqsilda ifodalanadi.
40
Mitoxondriyaning
NAD.N-oksidaza
va
suksinatoksidazalarining
aktivliklarini
aniqlash
uchun
bir
marta
muzlatilib
(-5-7
0
C)
eritilgan
mitoxondriyalardan foydalanildi [Almatov K.T. va boshqalar, 1993b]. NAD.N-
oksidazani aktivligini aniqlash uchun 1 mmol NAD.N, suksinatoksidazani
aktivligini aniqlash uchun 10 mmol suksinatni 1 ml.li polyagrafiya yacheykasiga
solindi. O’lchash muhiti: 0,25M saharoza, 10mM tris-Hcl (pH 7,4) lardan iborat
bo’ldi. Yacheykaga solingan mitoxondriyaning miqdori 3-5 mg oqsilni tashkil
qildi. Oksidazalarning aktivligi nanogramm atom kislorod/min mg oqsilda
aniqlandi.
Do'stlaringiz bilan baham: |