Mundarija kirish I bob koilin – rnk bog’lovchi funksiyalarga EGA multidomen oqsil

Mavzuning o’rganilgan darajasi: Bell, J. L. et al. Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins (IGF2BPs): post-transcriptional drivers of cancer progression? Cell. Mol. Life Sci. 70, 2657–2675 (2013). Mavzu boyicha shu va boshqa adabiyotlardan foydalanildi.
Kurs ishining maqsad va vazifalari. Oqsillarni identifikatsiyalash resursi mavzusini o’rganish hama mutatsion kasalliklarning oldini olish chora tadbirlarini rivojlantirishdan iborat.
Kurs ishining tuzilishi:Kurs ishi 1ta bob kirish ,asosiy qism, xulosa 3 ta rasm, foydalanilgan adabiyotlar ro’yxati, Jami 32 betdan iborat

I BOB Koilin – RNK bog’lovchi funksiyalarga ega multidomen oqsil

1. O'simlik koilin: tuzilish xususiyatlari va RNK-bog'lanish xususiyatlari

Kajal jismlar (CB) ribonukleoproteinlar biogenezida ishtirok etadigan dinamik subyadro bo'limlari. Coilin - bu CB shakllanishi, tarkibi va faoliyati uchun zarur bo'lgan asosiy strukturaviy iskala oqsilidir. Arabidopsis thaliana coilin (Atcoilin) ​​ning bashorat qilingan ikkilamchi tuzilishi oqsilning uchta asosiy domendan iborat ekanligini ko'rsatadi. O'chirish mutantlarining fizik xususiyatlarini tahlil qilish shuni ko'rsatadiki, Atkoilin N-terminal globulyar domendan, markaziy yuqori tartibsiz domendan va buzilgan C terminaliga ulashgan taxminiy Tudorga o'xshash tuzilmani o'z ichiga olgan C-terminal domenidan iborat bo'lishi mumkin. Aminokislotalar ketma-ketligidagi past homologiyaga qaramay, shunga o'xshash turdagi domen tashkiloti, ehtimol, inson va hayvonlarning koilin oqsillari va turli xil o'simlik turlarining koilinga o'xshash oqsillari tomonidan taqsimlanadi. Atkoilin RNKni samarali va o'ziga xos bo'lmagan tarzda bog'lashga qodir. Ushbu faollik uchta RNK-bog'lanish joylari tomonidan ta'minlanadi: N-terminal domenidagi asosiy aminokislotalarning ikkita to'plami va markaziy domendagi bitta to'plam. RNK bilan o'zaro ta'sir Atkoilin molekulasining multimerizatsiyasini keltirib chiqaradi, bu N-terminal domenidagi strukturaviy o'zgarishlarning natijasidir. RNK bilan o'zaro ta'sir va keyinchalik multimerizatsiya coilinning iskala oqsili sifatida ishlashini osonlashtirishi mumkin. N-terminal domenining modeli ham taklif qilingan. Kajal jismlar (CB), yadroviy va funktsional jihatdan yadrolar bilan bog'liq bo'lgan subyadro bo'linmalari, kichik yadroviy ribonukleoproteinlar (snRNP) ning pishishida ishtirok etadi va ularni kichik CB o'ziga xos RNKlar (scaRNAlar) orqali o'zgartirish va yig'ishni osonlashtiradi. Bundan tashqari, CBs snRNK genlari, giston gen klasterlari, Gems va PML jismlari bilan bog'lanadi, shuningdek, biogenez va telomerazani telomerlarga etkazishda ishtirok etadi. CB ko'pincha neyronlar va saraton hujayralari kabi yuqori transkripsiya talablari bo'lgan hujayralarda yoki viruslar bilan kasallangan hujayra qatorlarida aniqlanadi.

Coilin, CB hosil bo'lishi, tarkibi va faoliyati uchun zarur bo'lgan asosiy strukturaviy iskala oqsili, asosan CBlarda topiladi, lekin ayni paytda nukleoplazma bo'ylab tarqaladi Koilin ortologlari Ksenopus, sichqoncha, Arabidopsis va Drosophilada ketma-ket taqqoslash va klonlash yo'li bilan aniqlangan va bu organizmlardagi taniqli yadro jismlarida joylashishi ko'rsatilgan. Koilin aminokislotalar (aa) ketma-ketligi yoki o'lchamiga nisbatan kuchli evolyutsion saqlanmagan bo'lsa-da, sutemizuvchilar (odam va sichqon) koilin oqsillari istisno hisoblanadi, chunki ular o'xshash molekulyar massaga ega (60 kDa atrofida) va yuqori homologiya nisbati taxminan 67% umumiy va konservalangan hududlar uchun . Bundan farqli o'laroq, inson va Ksenopus coilin o'rtasidagi o'xshashlik bor-yo'g'i 42% ni tashkil qiladi, bunda Ksenopus coilinda topilgan 508 qoldiq bilan solishtirganda, inson spiralida 576 aminokislota qoldig'i mavjud. Umurtqasizlar turlarida homologiya darajasi past bo'lib, bu organizmlarda yangi koilin genlarini aniqlashni cheklab qo'ydi. Bu nima uchun coilin genlari Caenorhabditis va Saccharomyces kabi keng qo'llaniladigan model organizmlarda topilmaganligini tushuntirishi mumkin .

Yaqinda o'tkazilgan nokaut va nokaut tadqiqotlari koilinning to'g'ri CB shakllanishi, tarkibi va faoliyati uchun zarur ekanligini ko'rsatdi. HeLa hujayralarida koilinning ishdan chiqishi hujayra proliferatsiyasini kamaytirishi ko'rsatilgan ehtimol snRNP resurslarining tugashi tufayli. Sichqonlarda coilin geni nokautlari gomozigotalarning bir qismidagi o'lim yoki tirik qolganlarda jiddiy reproduktiv muammolarni keltirib chiqarishi bilan tavsiflangan subletal fenotipni keltirib chiqaradi . Aksincha, homozigotli Ncb-1 Arabidopsis thaliana mutantlari bo'lib, ular CB ni hosil qila olmasa ham, to'liq hayotga yaroqli. Shunga o'xshash natijalar drozofilaning koilin etishmovchiligi bo'lgan mutantlarida kuzatilgan, bu erda CB larning yo'qligi ularning yashash qobiliyatiga ta'sir qilmaydi
Turli xil turlardagi koilin oqsillarida ketma-ketlikni saqlaydigan ikkita muhim mintaqa aniqlangan . Bu hududlar oqsilning N- yoki C-terminal qismida ~100 aa qoldiqlarini o'z ichiga oladi, ularning joylashuvi bobin olingan turga qarab farq qilishi mumkin. Yuqori darajada saqlangan N-terminal domeni bobinning o'z-o'zini ta'sirini va oligomerizatsiyasini osonlashtiradi . Oxirgi ishlar shuni ko'rsatdiki, C-terminal saqlanib qolgan hududda Tudorga o'xshash domen mavjud bo'lib, u inson bobini holatida 460 va 560 aa qoldiqlari orasida joylashgan . Bu domen atipik hisoblanadi, chunki u ikkita katta tuzilmagan halqaga ega. Inson koilinning C-terminal qismida argininlar va glitsinlarga boy hudud (RG qutisi yoki takrorlash) mavjud bo'lib, u Tudorga o'xshash domenning N-terminali. N- va C-terminal domenlari orasidagi oqsilning markaziy qismida ikkita yadro lokalizatsiya signali ketma-ketligi (NLS1 va NLS2) va taxminiy yadroviy lokalizatsiya signali (NoLS) aniqlangan. Qizig'i shundaki, C-terminusning eng distal uchining so'nggi 10 ta qoldig'i o'z-o'zidan o'zaro ta'sir qilish uchun N-terminusning mavjudligini nazorat qilish, CB shakllanishi va soniga ta'sir qilish va bobinning lokalizatsiyasini modulyatsiya qilishda ishtirok etadi . Afsuski, hozirgi kunga qadar domenni tashkil etish va coilinning strukturaviy jihatlari aniqlanmagan.
Coilin omon qolgan motor neyroni (SMN), U snRNPs va Sm oqsillari bilan bevosita o'zaro ta'sir qiladi . SMN ning ulanishi RG qutisi orqali amalga oshiriladi, bunda arginin qoldiqlarining nosimmetrik dimetilatsiyasi SMN/koilin o'zaro ta'sirini oshiradi . Qizig'i shundaki, Arabidopsis thaliana coilin (Atcoilin) ​​tarkibida RG qutisi mavjud emas va hozirda Atcoilin tarkibidagi arginin qoldiqlaridan birortasi dimetilatlanganligi ma'lum emas. Xuddi shunday, hozirda Arabidopsis genomida SMN ning gomologi aniqlanmagan . Sm oqsili va U snRNP bilan bog'lanishi uchun inson spiralining C-terminal 156 qoldiqlari kerak bo'ladi . Coilin mitoz jarayonida giperfosforillangan konstitutsiyaviy fosfoproteindir . Koilinning fosforlanishi uning SMN va Sm oqsillari bilan o'zaro ta'sir qilish qobiliyatiga ham ta'sir qiladi: SMN gipofosforillangan koilin bilan bog'lanadi, lekin SmB' fosforlangan koilin bilan ko'proq bog'lanadi . Bundan tashqari, coilin Ku oqsillari bilan o'zaro ta'sir qiladi va in vitro homolog bo'lmagan DNK uchining qo'shilishini inhibe qilishi mumkin.
nukleoplazmatik koilin DNK shikastlanishi natijasida kelib chiqqan stressga javob yo'llarida rol o'ynashi mumkin. Koilinlarning nuklein kislotalar bilan o'zaro ta'siri haqida ko'p ma'lumotlar yo'q, ammo inson va Xenopus koilinlarining N-terminal qismi ssDNK va poli r (G) ni in vitro bog'lashi ko'rsatilgan. So'nggi ma'lumotlar shuni ko'rsatdiki, inson bobinlari RNK va DNK bilan birgalikda tozalangan, dsDNA bilan in vitro o'zaro ta'sirlashgan va snRNKni qayta ishlashda ishtirok etishi mumkin .
Ushbu ishda biz turli xil kelib chiqishi bo'lgan koilin oqsillari o'xshash tarkibiy tuzilishga ega ekanligini ko'rsatamiz, bu bizga Arabidopsis thaliana coilin molekulasidagi uchta strukturaviy domenni ochishga imkon berdi. Izolyatsiya qilingan domenlar rekombinant oqsillar sifatida ifodalangan va jismoniy va RNK-bog'lanish xususiyatlari aniqlangan, bu RNK-bog'lanish faolligi uchun mas'ul bo'lgan joylarni aniqlash imkonini beradi. CD spektroskopiyasi 1 mM fosfat tamponidagi pH 7,5 dagi 100 mkg/ml konsentratsiyadagi oqsil namunalari 1–2 mm hujayralarga yuklangan va CD spektrlari “Chiroscan” CD spektrometrida 25°C da 185 dan 250 nm gacha qayd etilgan (“Ilovaviy”). Fotofizika”, Angliya). CD spektrlari asosiy chiziqni olib tashlash bilan 0,5-1,0 nm / s tezlikda qayd etilgan. O'lchangan spektrlar asbob dasturi yordamida tekislandi. Qiymatini hisoblash aminokislota qoldig'ining o'rtacha molekulyar og'irligi 110 ga asoslangan.
Koilin oqsillari (0,03 mg/ml) yoki 1 mM fosfat tamponidagi pH 7,5 protein-RNK komplekslari FluoroMax (HORIBA Jobin Yvon, AQSH) spektrofluorimetrining 1 sm hujayralariga yuklangan. Namunalar 280 nm da hayajonlangan va emissiya spektrlari 300 dan 400 nm gacha bo'lgan diapazonda qayd etilgan. O'qish 25 ° C da amalga oshirildi.
0,05 mg/ml 1 mM fosfat tamponida pH 7,5 protein namunalari Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Buyuk Britaniya) dinamik yorug'lik tarqatuvchi qurilmaning 1 sm xujayralariga yuklangan va o'lchovlar He-Ne lazer (633 nm) yordamida olingan. . Egri chiziqlar Dispersion Technology Software (DTS) 5.10 versiyasi yordamida o'rnatildi.
Coilin oqsilining mutant variantlari Arabidopsis thaliana ketma-ketligidan foydalangan holda tuzilgan (NM_101173.4; GI: 42562030). O'chirish mutantlari kerakli ketma-ketlikning PCR kuchaytirilishi orqali ishlab chiqarilgan va SphI va SalI cheklash joylaridan foydalangan holda PQE30 ifoda vektoriga klonlangan. Olingan oqsillar N-terminusda 6 × gistidin ketma-ketligini o'z ichiga oladi. O'zgartirish mutatsiyalari (R yoki K ni alaninlar bilan almashtirish) bir-biriga o'xshash PCR yordamida yaratilgan.
E. coli ifodasi JM109 shtammi plazmidlar bilan o'zgartirildi va qiziqish oqsillari 1 mM IPTG ni 1/20 suyultirilgan tungi madaniyatga qo'shib, 37 ° C da 2 soat davomida yana chayqatildi. Proteinlar ishlab chiqaruvchining protokoliga binoan Ni-NTA Qiagen agaroza (Qiagen, G'arbiy Sasseks, Buyuk Britaniya) yordamida denaturatsiya sharoitida tozalandi.
Strukturaviy tadqiqotlar va RNK bilan bog'lanish tahlillari uchun rekombinant oqsillar renaturatsiya qilindi va karbamid 0,1 ml namunani MilliQ suvida 1,5 soat davomida xona haroratida 5 marta suv o'zgarishi bilan dializlash orqali olib tashlandi. Namunalar 10 000 aylanish tezligida 10 daqiqa davomida santrifüjlash orqali tozalash uchun aylantirildi.
Oqsillarning RNK bilan bog'lanish faolligi gel-shift yondashuvi yordamida sinovdan o'tkazildi. RNK va oqsil turli nisbatlarda RNK bog'lovchi buferda (20 mM Tris-HCl pH 7,5; 1 mM DTT; 3 mM MgCl2; 50 mM NaCl) aralashtirildi va muzda 15 daqiqa davomida inkubatsiya qilingandan so'ng namunalar Tris-asetat agarozaga yuklandi. etidium bromidi yoki Sybr Gold nuklein kislotasi jeli (Invitrogen) bilan bo'yalgan jellar. Jellar suratga olindi va erkin kechikmagan RNK miqdori Gel-Pro Analyzer (Version 3.1.00.00, Media Cybernetics) yordamida aniqlandi. U1 snRNK, U2 snRNK va pGEM7 RNK substratlari mos keladigan DNK ketma-ketligiga ulashgan T7 promouterini o'z ichiga olgan PCR mahsulotlarining T7 transkripsiyasi orqali tayyorlangan.
Protein eritmasi yangi uzilgan slyuda yuzasiga 1 daqiqa davomida adsorbsiyalanishiga ruxsat berildi, shundan so'ng eritma filtr qog'ozi bilan ehtiyotkorlik bilan olib tashlandi. Ushbu substrat darhol bir tomchi ikki marta distillangan Millipore suviga qo'yildi (bu protsedura ikki marta takrorlandi) va sirt havo bilan quritildi. Ushbu namunani tayyorlash usuli qolgan tuzlarni yo'q qilish va quritish paytida artefakt birikmasini minimallashtirish uchun ishlatilgan. Atom kuch mikroskopiyasi (AFM) tahlili ushbu namunalarda Nanoskop IIIA boshqaruvchisi (Digital Instruments, AQSH) bilan Multimode AFM yordamida, odatda 1 Gts skanerlash tezligi bilan teginish rejimida amalga oshirildi. O'lchovlar havoda teginish rejimida 10 nm kafolatlangan uchi radiusi bo'lgan o'tkir kremniy konsollari (NT-MDT, Rossiya) yordamida amalga oshirildi. Koilin molekulalarida ichki tartibsiz hududlar mavjudligini ko'rsatadigan bir nechta belgilar mavjud. Birinchidan, turli organizmlarning koilin molekulalari kutilmagan elektroforetik harakatchanlikka ega ekanligi ma'lum bo'ldi, buning natijasida janob va prognoz qilingan MW o'zaro bog'liq emas , ; inson, sichqon va Xenopus coilin oqsillari bilan kuzatilgan hodisa. Bu janob 90 kDa ga yaqin bo'lgan Atkoilinga ham tegishli, garchi u prognoz qilingan MVt 68,7 kDa bo'lsa ham. Ikkinchidan, barqaror to'liq uzunlikdagi inson kristallarini ishlab chiqarishga bir nechta muvaffaqiyatsiz urinishlar bo'lgan. Tartib/tartibsizlik darajasini aniqlash uchun Atkoilinning aminokislotalar ketma-ketligi FoldIndex va DisoPred veb-xizmatlari yordamida tahlil qilindi. Shakl 1B shuni ko'rsatadiki, oqsilning markaziy qismi juda tartibsiz bo'lib, C-terminusda qo'shimcha ochilgan hududlar aniqlangan. Aksincha, konservativ N-terminal mintaqasi va C-terminal qismidagi qismlar Tudorga o'xshash domen tuzilishiga mos keladi deb taxmin qilingan.
Koilin tuzilishining bioinformatik prognozlaridan foydalanib, biz Atcoilin N-terminal qismida ikkita tizimli domenni o'z ichiga oladi, shu jumladan N terminalida tartiblangan domen (NOD) va markaziy ichki tartibsiz domen (IDD) va C-da kamida bitta domenni o'z ichiga oladi. Terminal qismi (C-terminal domeni, CTD) o'ziga xos tarzda tartibsiz C-terminusga tutashgan Tudorga o'xshash tuzilishga ega .
Qizig'i shundaki, aminokislotalar ketma-ketligidagi sezilarli farqga qaramay, turli organizmlarning koilin oqsillarida tartiblangan/tartibsiz hududlarning o'xshash namunasi aniqlangan. Masalan, odamlardan olingan koilin oqsillari, Danio rerio va Xenopus laevis tuzilgan N-terminal mintaqasini (taxminan 100 aa), uzoq markaziy tartibsiz mintaqani va tartiblangan va tartibsiz qismlarni o'z ichiga olgan C-terminal mintaqasini taqsimlaydi.
Atkoilinning strukturaviy xususiyatlari va uning doiraviy dikroizm va triptofan floresan usullari bilan ochilgan taxminiy domenlari
Yovvoyi turdagi (wt) Atkoilin va uning taxminiy NOD (1-117 aa qoldiqlari), IDD (117-350 aa qoldiqlari) va CTD (350-608 aa qoldiqlari) domenlariga mos keladigan rekombinant oqsillar ifodalangan va tozalangan. E. coli Ularning ikkilamchi tuzilishi dumaloq dikroizm (CD) yondashuvi yordamida tahlil qilindi.

2. Multidomenli RNK-bog'lovchi protein IMP3 tomonidan klasterli RNK elementlarini kombinatsion tanib olish

Ko'p domenli RNKni bog'laydigan oqsillar o'zlarining kombinator kodiga asoslangan maqsadli ketma-ketliklarini qanday tan olishlari hal qilinmagan asosiy savol bo'lib, hozirgacha tizimli ravishda o'rganilmagan. Bu erda biz ko'p domenli RNK-bog'lovchi prototipli oqsilga e'tibor qaratamiz, IMP3 (shuningdek, IGF2BP3 deb ataladi), u oltita RNK-bog'lovchi domenni (RBD) o'z ichiga oladi: to'rtta KH va ikkita RRM domenlari. Biz bir domenda hal qilingan SELEX-seq, motiflar oralig'i tahlillari, in vivo iCLIP, funktsional tekshirish tahlillari va strukturaviy biologiyani birlashtirgan integrativ tizimli strategiyani yaratamiz. Ushbu yondashuv IMP3 ning RNK-bog'lash o'ziga xosligini va RNP topologiyasini aniqlaydi, unda barcha oltita RBD va beshtagacha aniq va mos ravishda joylashgan CA-ga boy va GGC-yadro RNK elementlaridan iborat klaster mavjud bo'lib, >100 nukleotid uzunlikdagi maqsadli RNK hududini qamrab oladi. Bizning umumiy qo'llaniladigan yondashuvimiz IMP3-RNKni tanib olishning o'ziga xosligini va moslashuvchanligini tushuntiradi, IMP3 maqsadlarini bashorat qilishga imkon beradi va genlarni tartibga solishda ko'p domenli RNKni bog'laydigan oqsillar bilan ko'p valentli o'zaro ta'sirlar funktsiyasi uchun paradigmani taqdim etadi.
Insulinga o'xshash o'sish omili 2 mRNK-bog'lovchi protein 3 (IMP3 yoki IGF2BP3) mRNAs1 ning transkripsiyadan keyingi gen regulyatsiyasida ishtirok etadigan uchta yuqori darajada saqlanib qolgan RNK-bog'lovchi oqsillar (IMP1, IMP2 va IMP3) oilasiga tegishli. Sutemizuvchilarning uchta paralogi, asosan, embriogenez davrida namoyon bo'lishi va ekspressiya buzilgan taqdirda og'ir fenotiplar tufayli ko'pincha onkofetal sifatida tavsiflanadi2,3.
RNK taqdirini modulyatsiya qilishning hozirda eng yaxshi tushunilgan IMP vositachiligi mexanizmi mRNP granulalaridagi maxsus transkriptlarning xavfsiz joylashuvini o'z ichiga oladi4. mRNKlarning bu qafaslari o'zining funktsional spektrida sitoplazmatik tashish5, barqaror mRNPs6,7,8 ichida kechikkan tarjima, sitoplazmatik saqlash va miRNK tomonidan boshqariladigan mRNKni erta tartibga solishdan himoya qilishdan iborat bo'ladi3,9,10,11,12. Bir nechta maqsadli RNKlar taklif qilingan3,13, IMP1 ACTB mRNA zipcode elementi bilan bog'langan va barcha uchta IMP 3′-UTR orqali HMGA2 barqarorligini tartibga soluvchi hozirda eng yaxshi o'rganilgan misollar9,10,11,12,14,15,16 .
IMP1 va IMP2 dan farqli o'laroq, IMP3 ning biologik ahamiyati uzoq vaqt davomida etarlicha baholanmagan. IMP3 bo'yicha tadqiqotlar asosan uning saraton bilan bog'liq ko'plab o'sma ob'ektlari bilan bog'lanishiga qaratilgan, chunki uning qayta ifodalanishi bemorlar uchun yomon prognoz bilan bog'liq bo'lib, IMP3 ni o'simta belgisi sifatida tasniflaydi17,18,19.
IMP oqsillari oilasi ko'p domenli RBPlarning prototipik namunasini ifodalaydi va oltita potentsial RNKni bog'lash birliklarining umumiy arxitekturasi bilan tavsiflanadi: ikkita N-terminal RNKni aniqlash motivlari (RRMs) va to'rtta ketma-ket hnRNP K-homologiyasi (KH) domenlari1. RNK-maqsadni aniqlashda bir nechta RBD qanday hamkorlik qiladi, bu uzoq vaqtdan beri davom etayotgan savol edi: alohida domenlarning qaysi biri ishtirok etadi, ularning hissasi qanday va RNK-oqsil o'zaro ta'siri qanchalik moslashuvchan?
Ko'p qismli RNK motivlari bilan bog'lanishda bir nechta RBDlarning hissasi va kooperativligini baholash qiyin va umuman qo'llaniladigan yondashuv hozircha tasvirlanmagan. Bir nechta RBDlarning potentsial dinamik domen tartiblari tufayli, tizimli tadqiqotlar yechim texnikasi va kristallografiyani birlashtirgan integratsiyalashgan yondashuvni talab qiladi20,21,22,23,24. IMPlar uchun strukturaviy ma'lumotlar faqat IMP2 (RRM1, PDB-ID: 2CQH) va IMP3 (RRM2, PDB-ID: 2E44, ikkalasi ham nashr etilmagan) ning yagona RRMlari uchun mavjud. Juda qisqa bog'lovchi ketma-ketlikning mavjudligi ikkita domen ixcham tandemda joylashganligini ko'rsatadi, bu ularning RNK o'ziga xosligini ta'minlaydi. Shunga o'xshab, KH1-2 va KH3-4 tandem domenlari ikki tomonlama RNK ketma-ketlik motivlarini tanib olish uchun oldindan tuzilgan RNK-bog'lash modullarini ifodalovchi dalillar mavjud. Inson IMP1 KH3–414 tuzilmalari, shuningdek, tovuq orfologi ZBP116 ning KH3–4 di-domenlari KH3 va 4 oʻrtasida kengaytirilgan domen interfeysi mavjudligini isbotladi. Bu tuzilmalar maqsadli RNK motiflarini minimal oraliqda boʻlishini tavsiya qiladi. tandem RBDlar tomonidan tan olingan. Masalan, ZBP1/IMP1 ning KH3–4 ikkita ketma-ketlik elementlari kombinatsiyasini taniydi: CGGAC-N10–25-(C/A–CA–C/U) ikkala mumkin boʻlgan tartibga solish14,15,16.
Oldingi tadqiqotlar in vivo CLIP3,13,25 va in vitro tanlovlari (SELEX, RNAcompete va Bind-N-seq) 5,26,27,28 ga asoslangan IMPlarni qisqacha tanib olish ketma-ketligini taklif qildi, bularning barchasi CA ga boy umumiy konsensusni taklif qildi. . Biroq, in vitro tanlash yondashuvlarining asosiy cheklovi shundaki, ular odatda faqat bitta RNK-bog'lovchi motivni sig'dira oladigan qisqa degenerativ ketma-ketliklardan boshlanadi. Shu sababli, alohida domenlarning hissasi qiyin bo'lib qoldi. Va nihoyat, oldingi tadqiqotlar KH domenlarining RNK o'zaro ta'sirida muhim rol o'ynashini isbotlagan bo'lsa-da, ikkita RRM 5,14,15,16,29,30 ga hali hech qanday funktsiya belgilanmagan.
IMP3-ni ko'p domenli RBPning prototip namunasi sifatida o'rganish uchun biz RNK-seq va kombinatoryal bioinform bilan birlashtirilgan tizimli, domenda echilgan SELEX protsedurasini o'rnatdik. atik yondashuvlar. Muhimi, biz SELEX uchun asos sifatida juda uzoq degeneratsiya ketma-ketligini (N40) ishlatdik, bu bittadan ortiq RNK-bog'lovchi domenga ega bo'lgan bir nechta RNK kontaktlariga ruxsat berish va tegishli bioinformatik intervallarni tahlil qilish. Bu bizni IMP3 o'zining barcha tandem RNK-bog'lovchi domenlarining faolligi orqali - umumiy GGC yadrosi bo'lgan CA ga boy motivlar va ketma-ketliklardan tashkil topgan bir nechta cis-ta'sir qiluvchi RNK elementlarining kengaytirilgan qatorini tan olishini kashf qilishga olib keldi. Ushbu biokimyoviy topilmalar IMP3 KH va RRM-tandem domenlarining strukturaviy tahlili va RNK-bog'lanish tadqiqotlari uchun kristallografiya va NMRni birlashtirgan integratsiyalashgan strukturaviy biologiya tomonidan qo'llab-quvvatlanadi.
Birgalikda biz RNK elementlarining tartiblangan qatorini IMP3 tomonidan tanib olish uchun biokimyoviy, bioinformatik va tizimli dalillarni taqdim etamiz, ular ma'lum bir oraliq naqshida joylashtirilgan va 100 nts dan ortiq bo'lishi mumkin bo'lgan hududlarni qamrab oladi. Ushbu model endogen IMP3 maqsadli mRNKlarini, shu jumladan yaxshi o'rganilgan HMGA2 transkriptini tahlil qilish bilan qo'llab-quvvatlanadi, buning uchun biz IMP3 va let-7 miRNK o'rtasidagi funktsional o'zaro tartibga solishni o'rgandik. Xulosa qilib aytganda, biz yirik tartibga soluvchi mRNP komplekslarini tekshirish uchun asosni taqdim etamiz. Shunday qilib, biz har qanday ko'p domenli RNK-bog'lovchi oqsilga qo'llanilishi mumkin bo'lgan murakkab va kombinatoryal RNP tarmoqlarini tizimli ravishda ajratish uchun umumiy yondashuvni o'rnatamiz.
IMP3 bir qator ketma-ketlik elementlarini taniydi.
I
MP3 ning murakkab RNK-bog'lash xususiyatlarini sindirish uchun biz individual, GST yorlig'i ostidagi subdomenlardan foydalandik va in vitro SELEX protsedurasini qo'lladik, shu jumladan tasodifiy N40-RNK hovuzi va keyingi RNK-seq tahlili bilan to'rtta tur tanlovi (1a-rasm, b va qo'shimcha 1-rasm). E'tibor bering, standart qisqa degeneratsiya hududlari o'rniga biz bir nechta motiflarning massivlarini, jumladan, ularning oralig'ini ajratish va tahlil qilish imkoniyatiga ega
1-rasm

bo'lish uchun N40-RNK hovuzidan foydalanganmiz; bundan tashqari, biz tanlovning har bir bosqichidan keyin ketma-ketlikni amalga oshirdik, bu SELEX protsedurasi davomida ketma-ketlikni boyitish imkonini berdi.

atik yondashuvlar. Muhimi, biz SELEX uchun asos sifatida juda uzoq degeneratsiya ketma-ketligini (N40) ishlatdik, bu bittadan ortiq RNK-bog'lovchi domenga ega bo'lgan bir nechta RNK kontaktlariga ruxsat berish va tegishli bioinformatik intervallarni tahlil qilish. Bu bizni IMP3 o'zining barcha tandem RNK-bog'lovchi domenlarining faolligi orqali - umumiy GGC yadrosi bo'lgan CA ga boy motivlar va ketma-ketliklardan tashkil topgan bir nechta cis-ta'sir qiluvchi RNK elementlarining kengaytirilgan qatorini tan olishini kashf qilishga olib keldi. Ushbu biokimyoviy topilmalar IMP3 KH va RRM-tandem domenlarining strukturaviy tahlili va RNK-bog'lanish tadqiqotlari uchun kristallografiya va NMRni birlashtirgan integratsiyalashgan strukturaviy biologiya tomonidan qo'llab-quvvatlanadi.
Bundan tashqari, oldingi tizimli tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, hech bo'lmaganda tegishli ZBP1 / IMP1 ning 3-4 KH domenlari funktsional psevdo dimer sifatida tashkil etilgan (Kirish bo'limiga qarang). Shuning uchun biz tahlillarimiz uchun qisqartirilgan tandem domenlariga tayandik: RRM1–2, KH1–2, KH3–4, shuningdek, KH1–4 toʻrtta KH domenini oʻz ichiga olgan kengaytirilgan versiya (1a-rasm va 1-rasm). Parallel ravishda, to'liq uzunlikdagi IMP3 (musbat nazorat sifatida) va faqat GST (salbiy nazorat sifatida va fonni tuzatish uchun) tahlil qilindi. Z-skorni hisoblash orqali motivlarni boyitish tahlili barcha mumkin bo'lgan 4-, 5- va 6-merlar uchun amalga oshirildi va har bir turda tegishli GST SELEX raundida tuzatildi (1c-rasmdagi eng yaxshi 10 ta boyitilgan 6-mer motivlari) ; Qo'shimcha ma'lumotlarda to'liq ma'lumotlar to'plami 1). Bunga parallel ravishda, motivlarni boyitish ma'lumotlar to'plamining korrelyatsiyasi ijobiy nazorat, to'liq uzunlikdagi IMP3 bilan solishtirish orqali har bir tandem domen uchun sinovdan o'tkazildi (1-rasm).
To'liq uzunlikdagi IMP3 oqsili uchun ushbu SELEX tahlili boyitilgan motiflarning ikkita populyatsiyasini, CA ga boy naqshlarni, shuningdek, GGC yadroli naqshlarni aniqladi (GGCA va CGGC; 1c-rasm). N-terminal RRM domenlariga ega bo'lmagan KH1-4 varianti to'liq uzunlikdagi oqsil kabi juda o'xshash motiv boyitishini ko'rsatdi, bu to'rtta KH domeni ikkala turdagi motivlarni taniydi (1c, d-rasm). KH1-2 va KH3-4 tandem domenlarining alohida tahlili, shuningdek, eng yaxshi 30 geksamer ichida GGC yadrosi elementlarining boyitilganligini ko'rsatdi (Qo'shimcha ma'lumotlar 1), lekin eng ko'p boyitilgan ketma-ketliklar CA- (KH1-2) yoki CA edi. /AU-boy (KH3-4), har bir tandemning KH domenlaridan kamida bittasi bunday ketma-ketlikni bog'lashini ko'rsatadi (1,-rasm, AU ketma-ketliklarini boyitish uchun, xususan, KH3-4, Muhokama bo'limiga qarang. Bo'lim).
Eng ajablanarlisi shundaki, biz shu paytgacha RNKni bog'lashda ishlamaydigan deb ta'riflangan RRM1-2 aslida CA-ga boy va CA-takrorlash ketma-ketliklarini afzal ko'rishini aniqladik, lekin GGC-yadro elementlari uchun emas (1c-rasm). , d). Bu o'ziga xoslik ikkinchi SELEX raundidan keyin kuzatildi, lekin 3 va 4-raundlarda qattiqroq yuvish shartlari bilan yo'qoldi. Shuning uchun RRM1-2 hosilasi uchun faqat birinchi ikkita SELEX bosqichi tahlil qilindi (Muhokamaga qarang). Bundan tashqari, to'liq to'plam o'rtasidagi barcha SELEX raundlarini taqqoslash shuni ko'rsatdiki, kutilganidek, KH1-2, KH3-4 va uzunroq KH1-4 varianti eng ko'p mos keladi, RRM1-2 esa izolyatsiya qilingan KH domenlari bilan eng kam o'xshashlikni ko'rsatdi. (Qo'shimcha 1 va 2-rasmlar).
Birgalikda olingan holda, bizning topilmalarimiz KH tandem domenlari bilan bog'langan ikki xil turdagi motiflarning (CA-boy va GGC-yadroli elementlar) kengaytirilgan massivlarini differentsial tan olish uchun qat'iy bahs yuritadi. Bundan tashqari, biz RRM1-2 domenlari CA ga boy elementni qo'shimcha bog'lashiga hissa qo'shadigan dalillarni taqdim etamiz.
IMP3 tomonidan RNKni tanib olish modeli.
IMP3 ning turli domenlari bitta RNKdagi ketma-ket elementlarni qanday tan olishini aniqlash uchun biz SELEX-seq ma'lumotlarimizni 0-25 nts oynasidan foydalangan holda boyitilgan 4-mer motif birikmalari orasidagi masofani tahlil qildik (2-rasm). Ikki turdagi motiflarning boyitilgan kombinatsiyasi (CA-boy va GGC-yadro elementlari) va ularning oralig'i z-skor tahlili bilan o'lchandi Keyinchalik, IMP3 uchun motif oralig'ining aniq ko'rinishini olish uchun ushbu yondashuvni KH subdomenlariga qo'lladik. KH1-2, KH3-4 va KH1-4 subdomenlarining har biri uchun biz ikkita GGC-yadro elementidan biri (GGCA va CGGC) orasidagi masofani va tahlil qilish orqali aniqlangan CAga boy motivlar bilan mos kombinatsiyani tahlil qildik. to'liq uzunlikdagi oqsil (2-rasm, pastki).

2-rasm
Bo'shliqlar tahlili IMP3-bog'lovchi motivlarning konsensus qatorini ko'rsatadi. a Toʻliq uzunlikdagi IMP3 (yuqori) va RRM1–2 (oʻrta), KH1–2, KH3–4 va KH1–4 domenlari (pastki) uchun 0 va 25 nts oraligʻida motif birikmalarini boyitish z-skor va issiqlik xaritasi sifatida ko'rsatilgan. Ikki GGC yadro elementining (GGCA/CGGC) CA ga boy naqshlar bilan kombinatsiyasi toʻliq uzunlikdagi IMP3 va KH oʻz ichiga olgan lotinlar uchun, toʻliq uzunlikdagi ikkita GGC yadro elementining (GGC/GGC) birikmalari uchun koʻrsatilgan. Faqat IMP3. CA ga boy motivlar orasidagi masofa toʻliq uzunlikdagi IMP3 hamda RRM1–2 uchun tahlil qilindi (CA ga boy va GGC yadroli motivlarning barcha kombinatsiyalarining qisqacha mazmuni uchun Qoʻshimcha maʼlumotlar 2 va usullarga qarang). O'ng tomonda individual z-ball shkalalari berilgan. Taʼriflash uchun foydalaniladigan chegaradan yuqori z-balli pozitsiyalar doiralar bilan koʻrsatilgan (FL-IMP3 va RRM1–2: z-ball >4,6; KH1–2, KH3–4 va KH1–4: z-ball >2.5). b SELEX-seq tahliliga asoslangan IMP3 tomonidan RNKni tanib olish modeli. Toʻliq uzunlikdagi IMP3 maʼlumotlari tahlili shuni koʻrsatdiki, eng koʻp boyitilgan motivlar kombinatsiyasi qisqa yoki oʻrta oraliqli (CA-N0–) ikkita CAga boy motiflardir. 3-CA; CA-N7-20-CA, maksimal N13-16) yoki aniqlangan GGC-yadro elementlaridan biri bilan CA ga boy motivning kombinatsiyasi. Barcha kombinatsiyalar uchun (CA-GGCA, GGCA-CA, CA-CGGC va CGGC-CA) biz N2-11 nukleotidlarining qisqaroq oralig'ini kuzatdik, maksimal N4-6 da. Biroq, uzoqroq masofa ikkita juda o'xshash GGC elementlaridan biri uchun aniq aniqlandi (GGCA va CGGC): Faqat GGCA-N18-21-CA yoki CA-N22-25-CGGC boyitilgan, lekin tegishli teskari emas. orientatsiyalar (2-rasm, tepa). Bu shuni ko'rsatadiki, birinchidan, ushbu ketma-ketlik elementlari IMP3 tomonidan tan olinishi uchun mos ravishda joylashtirilishi kerak; ikkinchidan, ikkita motivning bir-biriga nisbatan joylashishi muhim va uchinchidan, ikkala GGC-yadro elementi ham farqli ravishda tan olingan ko'rinadi. Nihoyat, ikkita GGC elementining kombinatsiyasi, taqqoslaganda, boyitilmagan.
Keyinchalik, IMP3 uchun motif oralig'ining aniq ko'rinishini olish uchun ushbu yondashuvni KH subdomenlariga qo'lladik. KH1-2, KH3-4 va KH1-4 subdomenlarining har biri uchun biz ikkita GGC-yadro elementidan biri (GGCA va CGGC) orasidagi masofani va tahlil qilish orqali aniqlangan CAga boy motivlar bilan mos kombinatsiyani tahlil qildik. to'liq uzunlikdagi oqsil (2-rasm, pastki).
Ajablanarlisi shundaki, biz KH1-2 subdomaini faqat CA-ga boy motivlar va CGGC elementining mumkin bo'lgan yo'nalishlardan birida, optimal CA-N22-25-CGGC oralig'ida kombinatsiyani afzal ko'rishini aniqladik. Shu bilan birga, biz CA va GGC motiflarining nisbiy joylashuvi, shuningdek, bir turdagi GGC-yadro elementi (CGGC) uchun yuqori o'ziga xoslikni ta'kidlab, uchta boshqa kombinatsiyani tanlamadik. Ushbu kuzatish to'liq uzunlikdagi IMP3 oqsili uchun olingan natijalar bilan qo'llab-quvvatlanadi (2-rasm, tepa).
Bundan farqli o'laroq, KH3-4 GGCA-N17-25-CA uchun eng kuchli boyitilganligini ko'rsatdi, ammo shunga o'xshash darajada - CGGC-ni ham CA-ga boy motiv bilan, har qanday yo'nalishda va N21- oralig'ida tan oladi. 25 va N18-24 mos ravishda. To'liq uzunlikdagi IMP3 va KH1-2 kabi, CA-GGCA motif birikmasi KH3-4 uchun eng kam boyitilganligi aniqlandi.
Nihoyat, KH1–4 uchun biz GGCA-N15–25-CA va CA-N20–25-CGGC yoʻnalishlarini afzal koʻrgan holda alohida KH1–2 va KH3–4 domenlari uchun allaqachon kuzatilgan boyitilgan motif oraligʻi aralashmasini aniqladik. , balki CGGC-N15–22-CA uchun ham (2-rasm, pastki; Munozaraga qarang). Barcha tekshirilgan KH subdomenlari uchun qisqaroq intervallarni boyitish ayniqsa GGCA-CA va CGGC-CA kombinatsiyalarida kuzatildi (KH1–2: N0, KH3–4: N0–3 va KH1–4: N0–6), Ehtimol, bu motiflarning haqiqiy oraliqdan ko'ra 3'-CA kengaytmasini ifodalaydi, chunki ilgari e'lon qilingan ma'lumotlar KH di-domeni tomonidan tan olingan ikkita motif orasidagi minimal masofa talabi N10-25 bo'lishi haqida bahslashadi.
Bunga qo'shimcha ravishda, RRM1-2 uchun intervallarni tahlil qilish 25-nts oynasidagi barcha pozitsiyalarda CA-ga boy motif birikmalari uchun kuchli boyitilganligini ko'rsatdi, lekin GGC-yadro elementlari uchun emas (2-rasm, o'rta), yana yuqori afzallik uchun bahslashmoqda. kengaytirilgan CA ga boy takrorlash elementlari uchun oldingi tahlillarimiz bilan kelishilgan holda (1c-rasm, d, Munozaraga qarang). Yuqorida aytib o'tilganidek, biz barcha olti RBD (FL-IMP3) ning to'liq metrajli kontekstida ikkala yo'nalishda ham GGC va CA elementlari uchun N2-11 oralig'ida qisqaroq masofani kuzatdik. Barcha domenlar uchun oraliq/orientatsiya aralashmasi kutilayotgan bo‘lsa-da, KH1–4 bilan taqqoslash shuni ko‘rsatadiki, ayniqsa qisqaroq interval RRM1–2 ta’sirini aks ettiradi. Shuning uchun, biz buni KH domenlaridan biri bilan bog'langan GGC motivi va RRM1-2 tomonidan tan olingan yaqin atrofdagi CA elementi orasidagi masofa sifatida i
zohlaymiz.
3-rasm
Ushbu ma'lumotlar to'plamiga asoslanib, biz IMP3 RNKni qanday taniydigan ish modelini yig'dik (2-rasm). Muayyan motif tartiblarini tanlab boyitish va IMP1 paralogining KH3-4 subdomenlarining ma'lum ketma-ketlik afzalligi (Kirishga qarang) tufayli biz KH1 va KH4 ning har biri w ketma-ketlik elementlarini tanilishini taklif qilamiz. Bu umumiy GGC yadrosi, KH2 va KH3 esa CA ga boy naqshlar bilan bog'lanadi. RRMlar qo'shni CA ga boy naqshlar bilan qo'shimcha, barqarorlashtiruvchi shovqinni ta'minlashi mumkin. Shuni ta'kidlash kerakki, ushbu ketma-ketlik elementlarining simmetriyasi tufayli bizning oraliq tahlilimiz IMP3-ning maqsadli RNKlari bilan bog'lanishining ikkala qutblarini qisman qo'llab-quvvatlaydi. 2-rasmda keltirilgan ish modelimizni sinab ko'rish uchun biz SELEX tahlilimiz asosida domenga xos minimal 4-mer ketma-ketlik elementlarini o'z ichiga olgan RNK ketma-ketligini ishlab chiqdik, ular o'zaro bog'liq bo'lmagan ketma-ketliklar bilan mos ravishda joylashtirilgan va umumiy uzunligi 101 nts (101) ga cho'zilgan. -mer RNK): GGCA-N20-CACA-N14-CACA-N22-CGGC-N4-(CA)4 (3-rasm, toʻliq ketma-ketlik uchun quyida va qoʻshimcha maʼlumotlar 3-ga qarang).

3.