Mundarija kirish I bob koilin – rnk bog’lovchi funksiyalarga EGA multidomen oqsil

TIA-1 ko'p domenli biriktiruvchi omilning tuzilishi, dinamikasi va RNK bilan bog'lanishi

RNK-bog'lovchi oqsillar (RBP) odatda bu oqsillarni modulli arxitektura bilan ta'minlaydigan bir nechta RNK-bog'lovchi domenlarga (RBD) ega. To'plangan dalillar RBP arxitektura modulligi va moslashuvchanligi ularning RNK bilan o'zaro ta'sirining o'ziga xosligini aniqlaydi. Biroq, bir nechta RBD kontsertda o'zlarining qarindosh bir zanjirli RNK (ssRNA) ketma-ketligini qanday tan olishlari hali ham yaxshi tushunilmagan. Bu erda biz ushbu savolni hal qilish uchun N-Rasning yuqori oqimidan (Unr) namunaviy tizim sifatida foydalanamiz. Beshta ssRNK-bog'lovchi sovuq zarba domenini (CSD) o'z ichiga olganligi xabar qilingan bo'lsa-da, biz Unr RNKni (psevdo-RBD) bog'lamaydigan, lekin RNKning konformatsion heterojenligini kamaytirish orqali uchinchi darajali tuzilmaning o'ziga xosligini vositachilik qilishda ishtirok etadigan qo'shimcha to'rtta CSDni o'z ichiga olishini ko'rsatamiz. Unr. Kanonik va kanonik bo'lmagan CSD'lar o'rtasidagi o'zaro ta'sirlarni buzish RNK ​​ulanishiga, Unr vositachiligida tarjima regulyatsiyasiga va Unrga bog'liq bo'lmagan RNK interaktomiga ta'sir qiladi. Birgalikda olib borilgan tadqiqotlarimiz oqsil-RNKni tanib olishda yangi paradigmani ochib beradi, bu erda RBD va psevdo-RBD o'rtasidagi o'zaro ta'sir RNKning uchinchi tuzilmalarini tanlaydi, RNP yig'ilishiga ta'sir qiladi va maqsadning o'ziga xosligini belgilaydi.
T-hujayra hujayra ichidagi antigen-1 (TIA-1) ribonuklein kislotasini (RNK) bog'lovchi oqsil bo'lib, u turli xil pre-messenjer ribonuklein kislotasining (mRNKdan oldingi) muqobil qo'shilish regulyatsiyasida ishtirok etadi, shu kabi kodlangan oqsillarning turli funktsiyalari bilan. Drosophila yoki apoptozda jinsni aniqlashda, gomeostazda va odamlarda motor neyronlarining omon qolishida bo'lgani kabi . TIA-1 muqobil birlashmadagi rolidan tashqari, atrof-muhit ta'sirida sitoplazmadagi AU ga boy elementlar (ARE) bilan belgilangan 3' tarjima qilinmagan hududlarga bog'lanib, mRNK translatsiyasida vositachilik qilish va bostirishga qodir. Yaqinda TIA-1 5' terminal oligopirimidin-trakti (5' TOP) RNK bilan bog'lanish orqali translatsiya nazoratida ham ishtirok etdi.
TIA-1 Fas bilan faollashtirilgan serin/treonin kinaz (FAST-K) signal yo'li bilan bog'lanib, dasturlashtirilgan hujayra o'limiga vositachilik qiluvchi apoptozni rag'batlantiruvchi omil sifatida aniqlangan. TIA-1, dasturlashtirilgan hujayra o'limini qo'zg'atuvchi transmembran oqsilini kodlaydigan inson FAS pre-mRNKsini birlashtirganda 6-eksonni qo'shishga yordam beradi. FAS 6-eksonini o'tkazib yuborish orqali alternativ qo'shilish Fas oqsilining eriydigan anti-apoptotik shakliga olib keladi, bu otoimmün reaktsiyalar va tizimli qizil yuguruk bilan bog'liq. TIA-1 tomonidan splaysni tartibga solish uchun mo'ljallangan pre-mRNKlar 5' ulash joylaridan quyi oqimda joylashgan uridinga boy (U ga boy) qisqa cho'zilishlarga ega. Ushbu U ga boy RNK motivlari bilan bog'langandan so'ng, TIA-1/RNK kompleksi U1 snRNP bilan bog'langan U1C oqsili bilan o'zaro ta'sir qilish orqali U1 kichik yadroviy ribonukleoprotein (snRNP) tomonidan 5 'splice joyini aniqlashga yordam beradi . TIA-1 ning FAST-K tomonidan fosforillanishi FAS 6 eksonini kiritish uchun U1 snRNP ni jalb qilishni kuchaytirishi ko'rsatilgan .
TIA-1 va uning yaqin homologi TIA-1 bilan bog'liq protein, TIAR, insonning turli to'qimalarida va hujayra liniyalarida aniq ifoda naqshlariga ega . Ikkala oqsil ham hujayralarda keng tarqalgan va o'zlarining pre-mRNKlarini birlashtirishda vositachilik qiladi . Insonning ikkita TIA-1 izoformasi, TIA-1a va TIA-1b, xuddi shunday sub-hujayra taqsimoti va RNKni bog'lash faolligini ko'rsatadi. TIA-1a izoformasi RRM2 dan oldingi 11 aminokislotadan iborat bo'lib, 386 qoldiq oqsilga mos keladi. TIA-1b bu qo'shimchaga ega emas va TIA-1a bilan solishtirganda in vitro va in vivo bilan solishtirganda kuchaytirilgan qo'shilish stimulyator faolligini ko'rsatadi. TIA-1b ning biologik roli oldingi tadqiqotlarda yaxshi tavsiflanganligi sababli, ushbu tadqiqot TIA-1b ga qaratilgan bo'lib, bundan buyon TIA-1 deb nomlanadi. TIA-1 375 ta aminokislotalarni o'z ichiga oladi va uchta RNKni tanib olish motivlaridan (RRM1, RRM2 va RRM3) va glutaminga boy C-terminal domenidan (Q-boy domeni) (1A va B-rasm) va turli turlarning ketma-ketligini moslashtirishdan iborat. ClustalW2 va ESPript tomonidan solishtiriladi va tekislanadi. In vitro bog'lanish tadqiqotlari shuni ko'rsatadiki, uchta TIA-1 RRM domenlari RNKni bog'lash uchun turli imkoniyatlarga ega (12,17,24-25). Markaziy TIA-1-RRM2 mRNKdan oldingi maqsadlarga eng yuqori bog'lanish yaqinligini namoyish etadi, ammo RNKning ulanishi RRM3 mavjudligi bilan yanada kuchayadi. Yaqinda o'tkazilgan tadqiqot RRM3 ning N-terminal kengaytmasida histidin qoldig'ini o'z ichiga olgan AU ga boy RNKlar bilan bog'lanishning potentsial pH ga bog'liq regulyatsiyasini taklif qildi . Bundan farqli o'laroq, TIA-1-RRM1 Q-ga boy domenga protein-oqsil o'zaro ta'siri orqali U1 snRNP bilan bog'langan U1C proteinini jalb qilishda yordam beradi .
Hozirgi hisob-kitoblar shuni ko'rsatadiki, butun inson genomining taxminan 10% RNK-bog'lovchi oqsillarni (RBP) kodlaydi (Hentze va boshq., 2018). RBPlar transkripsiya, qo'shilish, poliadenilatsiya, lokalizatsiya, stabilizatsiya, degradatsiya, shuningdek, tarjimadagi rollari orqali oqsil sintezini o'z ichiga olgan barcha darajalarda gen ifodasini tartibga solish uchun kodlovchi va kodlanmaydigan RNKlar bilan o'zaro ta'sir qiladi (Cech va Steitz, 2014; Gerstberger va boshqalar. ., 2014; Hentze va boshqalar, 2018; Singh va boshqalar, 2015). Shunday qilib, RBPlarning disregulyatsiyasi yoki mutatsiyasi hujayra hayotiyligi va funktsiyasiga ta'sir qiladi va saraton (Pereira va boshq., 2017) va neyrodegeneratsiya (Konlon va Manley, 2017) kabi kasalliklar bilan bog'liq.
RBPlar o'zlarining maqsadli RNKlarini jalb qilish uchun RNK-bog'lovchi domenlardan (RBD) foydalanadilar. Ko'pgina RBPlar bir nechta RBDni o'z ichiga oladi, buning natijasida turli xil domen sinflarining kombinatsiyaviy xilma-xilligi va maqsadli RNK ketma-ketligini bog'lashning turli xil arxitekturalari va usullari mavjud. Ko'pgina hollarda bu domenlar moslashuvchan bog'lovchi hududlar bilan ajratiladi (Afroz va boshq., 2015; Gerstberger va boshq., 2014). RBPlarning modulli arxitekturasi va RBDlarning aniq fazoviy joylashuvi maqsadli RNK ulanishining o'ziga xosligi uchun juda muhim deb hisoblanadi. Umuman olganda, ko'pgina RBDlar faqat uch-beshta qo'shni RNK asoslarini sig'dira oladi, ulardan maqsadni murakkab hujayrali muhitda transkriptoma ichidagi maqsadli bo'lmagan RNKlardan ajratish uchun ishlatib bo'lmaydi. Shu sababli, bir yoki bir nechta RBP ichidagi bir nechta RBDlarning tarkibi va arxitekturasi o'ziga xoslikni ta'minlash uchun talab qilinadi (Auweter va boshq., 2006; Hennig va Sattler, 2015; Hennig va boshq., 2014a, 2014b). Yillar davomida RBP / RNKni bog'lashning o'ziga xosligini belgilaydigan strukturaviy xususiyatlarni o'rganish uchun bir qator harakatlar amalga oshirildi (Cléry and Allain, 2011). Ushbu sa'y-harakatlar bizning yagona RBD-larning maqsadli ketma-ketliklarini qanday jalb qilishini tushunishimizni oshirdi va ba'zi hollarda tanib olish jarayonida ko'p domenli kelishuvlarning roli haqida tushunchalarni taklif qildi. Bundan tashqari, in vitro va in vivo RBP / RNK bilan bog'langan landshaftni xaritalash bo'yicha urinishlar endi RBDlarning domen chegaralaridan tashqaridagi protein xususiyatlari o'ziga xoslikni yo'naltirishda muhim rol o'ynashini ta'kidladi (Sasse va boshq., 2018). Bundan tashqari, biz maqsadli RNKni tanib olishda maqsadning o'ziga bog'liq bo'lgan murakkab bog'lanish usullari qo'llanilishini, masalan, RNKning ikkilamchi va uchinchi darajali tuzilmalari, ikki tomonlama motivlarning mavjudligi va tarqalishi va yonbosh nukleotidlarning tabiati (Dominguez va boshq., 2018) . Shu bilan birga, bir nechta RBD o'zlarining bir-biriga bog'langan bir qatorli RNK (ssRNA) ketma-ketligini qanday qilib tan olishi haqida batafsil mexanik ko'rinish asosan etishmayapti.
RBP / ssRNK o'zaro ta'sirini strukturaviy tavsiflashdagi asosiy to'siq RBPlarning ko'p domenli va to'liq uzunlikdagi konstruktsiyalarini ifodalash va tozalash, shuningdek kristallanish yoki krio-elektron mikroskopiya (kriyo-EM) uchun yuqori sifatli namunalarni yaratishdagi texnik qiyinchiliklardan kelib chiqadi. tahlil. Ribosomalar (Bieri va boshq., 2018; Voorhees va Ramakrishnan, 2013) va spliceosomalar (Wan va boshq., 2019; Uilkinson va boshq., 2018). Bunday hollarda izolyatsiya va strukturaviy tavsifga mos keladigan barqaror yig'ilishni yaratish uchun ishtirok etishi kerak bo'lgan muhim tarkibiy qismlarni aniqlash bo'yicha yillar davomida olib borilgan yutuq ishlari hal qiluvchi rol o'ynadi. Shuning uchun, ushbu misollarda ko'rinib turganidek, interaktomani aniqlash batafsil strukturaviy va mexanik tadqiqotlarni amalga oshirishga qaratilgan kuchli strategiya bo'lishi mumkin.
Biroq, RBP larning katta qismi, ayniqsa uzoq kodlanmagan RNKlar (lncRNAs) bilan o'zaro ta'sir qiluvchilar, strukturaviy xarakteristikaga juda qattiq qarshilik ko'rsatmoqda. Ushbu hisobot taqdim etilgan paytdan boshlab, lncRNA bilan bog'liq strukturaviy ma'lumotlar, jumladan, Protein ma'lumotlari bankida ma'lum bo'lgan RBD va RBPlar, lncRNA bilan bog'liq bo'lgan ma'lumotlar soni cheklangan edi (ko'proq RNK va oqsil/RNK komplekslari 20 dan kam). 160 000 dan ortiq tuzilmalar haqida xabar berilgan). Bu erda biz N-Rasning yuqori oqimi (Unr), bir nechta RBDli RBP va modulli RBDlarning maqsadli RNKlarga nisbatan ketma-ketlik o'ziga xosligini tushunish uchun namunaviy tizim bo'yicha keng qamrovli va tizimli tadqiqotimiz natijalarini taqdim etish orqali ushbu muammoni hal qilamiz. Drosophila'da, Unr (dUnr) dozani qoplash vaqtida jinsga xos rollarni bajaradi. Urg'ochi chivinlarda dUnr, Sex-lethal (Sxl) bilan birgalikda dozani qoplash kompleksining (DCC) tezlikni cheklovchi komponenti bo'lgan Erkaklarga xos o'ldiradigan 2 (Msl2) ning tarjimasini bostiradi (Abaza va Gebauer, 2008; Abaza va boshqalar. ., 2006; Duncan va boshq., 2006), holbuki, erkak chivinlarda dUnr qarama-qarshi rolga ega va Erkaksiz (Mle) RNK helikazasi bilan birgalikda lncRNA roX2 (X 2 da RNK) ni qayta qurish uchun RNK shaperoni sifatida ishlaydi), bu DCC yig'ilishiga yordam beradi (Militti va boshqalar, 2014). Inson ortologi Unr/CSDE1 bir qancha hujayra jarayonlari, jumladan, hujayra migratsiyasi, differentsiatsiyasi va apoptoz bilan bog'liq bo'lib, u asosan hujayra o'zgarishini ta'minlaydi. maqsadli mRNKlarning tarjimasi va barqarorligini tartibga solish uchun sitoplazmatik RBP (Boussadia va boshq., 2003; Dormoy-Raclet va boshq., 2005). Transkripsiyadan keyingi tartibga solishdagi muhim rolini tasdiqlovchi Unr/CSDE1 kasalliklar, jumladan Diamond-Blackfan anemiyasi, autizm va saraton rivojlanishi bilan bog'liq (Fishbein va boshq., 2017; Guo va boshq., 2019; Horos va fon Lindern). , 2012; Sanders va boshqalar, 2012; Wurth va boshqalar, 2016; Xia va boshqalar, 2014).
Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, 1039 aminokislota (aa) uzunlikdagi protein bo'lgan Unr maqsadli RNKlarni jalb qilish uchun oqsillar ketma-ketligi bo'ylab teng ravishda taqsimlangan beshta sovuq zarba domenini (CSDs) ishlatadi (Jacquemin-Sablon va boshq., 1994). ). Ushbu modelda CSDlar butun proteinning taxminan 31% ni tashkil qiladi, bu esa oqsilning qolgan qismi tuzilmagan degan fikrga olib keladi. Oldingi tizimli tahlillar birinchi CSD ga qaratilgan (Hennig va boshq., 2014a). Ish ushbu mintaqaning dastlabki ko'rinishini taqdim etgan bo'lsa-da, maqsadli o'ziga xoslik bilan bog'liq savollar, ayniqsa to'liq uzunlikdagi protein kontekstida, izolyatsiya qilingan CSDlar nisbatan nopok RNK bog'lovchilari ekanligini kuzatishdan tashqari ko'rib chiqilmadi (Graumann va boshq., 1997; Jiang va boshq, 1997; Kljashtorny va boshq, 2015; Sachs va boshq., 2012; Yang va boshq., 2019a, 2019b; Zou va boshq., 2020) va Unrning maqsadli o'ziga xosligi to'liq metrajda oshishi mumkin. Unr yoki boshqa RBPlar bilan hamkorlikda bog'lanish paytida (Hennig va boshq., 2014a).
Ushbu tadqiqotda biz Unr ning strukturaviy va RNK bilan bog'lanish xususiyatlarini o'rganish uchun bir qator biokimyoviy, strukturaviy, hujayraga asoslangan, RIP-seq (RNK immunoprecipitatsiyasi va keyingi avlod sekvensiyasi) va proteomik yondashuvlardan foydalanamiz. Bizning ko'p qirrali yondashuvimiz kutilmagan kashfiyotga olib keldi, Unr to'rtta qo'shimcha CSD o'z ichiga oladi. Ushbu CSDlar ilgari aniqlangan beshta CSD bilan yuqori tizimli o'xshashlikni namoyish etadi. Biroq, biz ular RNKni to'g'ridan-to'g'ri bog'lamasligini, aksincha, iskala rolini o'ynashini va oqsilni barqarorlashtiradigan va Unr interaktomidagi RNK va boshqa bog'lovchi sheriklar bilan o'zaro ta'sirlarni barqarorlashtiradigan interdomen aloqalarini o'rnatishini ko'rsatamiz. Shunday qilib, ushbu kanonik bo'lmagan CSD'lar (ncCSD'lar) RBD / RNKni tanib olishda yangi paradigmani ifodalaydi, bunda tuzilgan psevdo-RBD va domenlararo o'zaro ta'sirlar RNP maqsad o'ziga xosligiga ta'sir qiladi.
Unr yangi ncCSD-larni o'z ichiga oladi dUnr strukturasini aniqlash uchun biz dastlab “boʻl va zabt et” yondashuvidan foydalandik va ifoda va eruvchanlik chegaralari turlicha boʻlgan 117 ta konstruksiyani sinovdan oʻtkazdik (jadval S1). Chegaralar JPred4 (Drozdetskiy va boshq., 2015) yordamida ikkilamchi tuzilma prognozlariga asoslanib, bashorat qilingan CSD (1A-rasm) va N- va C-terminal kengaytmalarini qamrab olish uchun tanlangan. Ajablanarlisi shundaki, ko'pchilik eruvchan konstruktsiyalar prognoz qilingan CSD chegaralaridan tashqarida qo'shimcha hududlarni o'z ichiga oladi va 1H,15N-HSQC NMR spektrlariga asoslangan tuzilgan domenlarning xususiyatlarini namoyish etdi (S1A-rasm). Biz to'rt xil konstruksiyaning kristall va/yoki NMR tuzilmalarini hal qildik (1B va S1B–S1D-rasmlar; S2 va S3 jadvallari; PDB: 6Y6M, 6Y6E, 6Y4H va 6Y96), bu mavjud bo'lganlar orasida qo'shimcha CSD mavjudligini aniq ko'rsatdi. allaqachon aniqlangan (1B-rasm; S1E–S1G rasmlari). Ushbu qo'shimcha CSD'lar boshqa CSD'larga tizimli ravishda juda homologdir (S1E-S1G rasmlari, o'rtacha kvadrat og'ishlari [RMSDs] 0,7 va 2,5 Å orasida) va b-barrelni tashkil etuvchi besh antiparallel b-varaqning odatiy joylashuvini ko'rsatdi. Biroq, bu qo'shimcha domenlarda saqlanib qolgan RNK-bog'lovchi kanonik qoldiqlar (FGF va (F/Y)FH; 1C-rasm) yo'q, ular kanonik CSD tuzilmalarida barrelning tashqi tomoniga ishora qilgani aniqlandi (S1G-rasm). Yana bir o'ziga xos xususiyat - bu protein-oqsil o'zaro ta'sir platformasi bo'lishi mumkin bo'lgan b1 va b2 (1C va S1E-rasmlar) o'rtasidagi kengaytirilgan halqa. Ushbu farqlarga asoslanib, biz ushbu yangi kashf etilgan domenlarni ncCSDs deb nomlaymiz va mavjud Unr modelini dastlab izohlangan beshta CSD (hozirda 1 raqamlangan) orasiga qo'shimcha to'rtta ncCSD (bu erda 2, 4, 6 va 8 raqamlari) kiritish uchun qayta ko'rib chiqamiz. 3, 5, 7 va 9)

Xulosa.

Xulosa qilib shuni aytish mumkinki oldingi tadqiqotlar in vivo CLIP3,13,25 va in vitro tanlovlari (SELEX, RNAcompete va Bind-N-seq) 5,26,27,28 ga asoslangan IMPlarni qisqacha tanib olish ketma-ketligini taklif qildi, bularning barchasi CA ga boy umumiy konsensusni taklif qildi. . Biroq, in vitro tanlash yondashuvlarining asosiy cheklovi shundaki, ular odatda faqat bitta RNK-bog'lovchi motivni sig'dira oladigan qisqa degenerativ ketma-ketliklardan boshlanadi. Shu sababli, alohida domenlarning hissasi qiyin bo'lib qoldi. Va nihoyat, oldingi tadqiqotlar KH domenlarining RNK o'zaro ta'sirida muhim rol o'ynashini isbotlagan bo'lsa-da, ikkita RRM 5,14,15,16,29,30 ga hali hech qanday funktsiya belgilanmagan.
IMP3-ni ko'p domenli RBPning prototip namunasi sifatida o'rganish uchun biz RNK-seq va kombinatoryal bioinform bilan birlashtirilgan tizimli, domenda echilgan SELEX protsedurasini o'rnatdik. atik yondashuvlar. Muhimi, biz SELEX uchun asos sifatida juda uzoq degeneratsiya ketma-ketligini (N40) ishlatdik, bu bittadan ortiq RNK-bog'lovchi domenga ega bo'lgan bir nechta RNK kontaktlariga ruxsat berish va tegishli bioinformatik intervallarni tahlil qilish. Bu bizni IMP3 o'zining barcha tandem RNK-bog'lovchi domenlarining faolligi orqali - umumiy GGC yadrosi bo'lgan CA ga boy motivlar va ketma-ketliklardan tashkil topgan bir nechta cis-ta'sir qiluvchi RNK elementlarining kengaytirilgan qatorini tan olishini kashf qilishga olib keldi. Ushbu biokimyoviy topilmalar IMP3 KH va RRM-tandem domenlarining strukturaviy tahlili va RNK-bog'lanish tadqiqotlari uchun kristallografiya va NMRni birlashtirgan integratsiyalashgan strukturaviy biologiya tomonidan qo'llab-quvvatlanadi.
Birgalikda biz RNK elementlarining tartiblangan qatorini IMP3 tomonidan tanib olish uchun biokimyoviy, bioinformatik va tizimli dalillarni taqdim etamiz, ular ma'lum bir oraliq naqshida joylashtirilgan va 100 nts dan ortiq bo'lishi mumkin bo'lgan hududlarni qamrab oladi. Ushbu model endogen IMP3 maqsadli mRNKlarini, shu jumladan yaxshi o'rganilgan HMGA2 transkriptini tahlil qilish bilan qo'llab-quvvatlanadi, buning uchun biz IMP3 va let-7 miRNK o'rtasidagi funktsional o'zaro tartibga solishni o'rgandik. Xulosa qilib aytganda, biz yirik tartibga soluvchi mRNP komplekslarini tekshirish uchun asosni taqdim etamiz. Shunday qilib, biz har qanday ko'p domenli RNK-bog'lovchi oqsilga qo'llanilishi mumkin bo'lgan murakkab va kombinatoryal RNP tarmoqlarini tizimli ravishda ajratish uchun umumiy yondashuvni o'rnatamiz.
IMP3 bir qator ketma-ketlik elementlarini taniydi
IMP3 ning murakkab RNK-bog'lash xususiyatlarini sindirish uchun biz individual, GST yorlig'i ostidagi subdomenlardan foydalandik va in vitro SELEX protsedurasini qo'lladik, shu jumladan tasodifiy N40-RNK hovuzi va keyingi RNK-seq tahlili bilan to'rtta tur tanlovi (1a-rasm, b va qo'shimcha 1-rasm). E'tibor bering, standart qisqa degeneratsiya hududlari o'rniga biz bir nechta motiflarning massivlarini, jumladan, ularning oralig'ini ajratish va tahlil qilish imkoniyatiga ega bo'lish uchun N40-RNK hovuzidan foydalanganmiz; bundan tashqari, biz tanlovning har bir bosqichidan keyin ketma-ketlikni amalga oshirdik, bu SELEX protsedurasi davomida ketma-ketlikni boyitish imkonini berdi.