Микробиологик лаборатория юқимли касалликларга ташхис қўйиш даволаш ва профилактика ишларини олиб бориш учун микроорганизмларниниг хусусиятларини ўрганади

Mikrobiologik tekshirish usullari

1. Mikroskopik usul — tekshirish materialidan surtma preparat

tayyorlanib, bo‘yab mikroskop ostida tekshiriladi. Bu usulda mikro-
organizmlarning morfologiyasi o‘rganiladi, shunga asoslanib kasal-
liklarga tashxis qo‘yiladi. Masalan, so‘zak (gonoreyalar), bo‘g‘ma,
qaytalama tif, zaxm va boshqalar.

2. Mikrobiologik usul — tekshirish materialini oziqa muhitiga ekib,

sof kulturasi ajratib olinadi va shu qo‘zg‘atuvchining xossalari o‘r-
ganiladi.

3. Serologik usul (lotin. serum — zardob) — bemor qon zar-

dobidagi noma’lum antigen va antitelo aniqlanadi.

4. Biologik usul — laboratoriya hayvonlariga tekshirish materiali

Mikrobiologiyaning asosiy oʻrganish obʼyektlari bakteriyalar, achitqi zamburugʻlar, aktinomitsetlar va viruslar hisoblanadi. Lekin Mikrobiologiya metodlaridan zamburugʻlar va boshqa mikroorganizmlarni hamda yuksak tuzilgan koʻp hujayralilar hujayralarini oʻstirishda ham foydalaniladi. Zamonaviy Mikrobiologiya bir qancha mustaqil fanlarga ajratiladi.
Sanoat (texnik) Mikrobiologiyasi ogʻir, yengil va asosan, oziq-ovqat sanoati tarmoqlarida uchraydigan zararkunanda hamda oziq mahsulotlarini ishlab chiqarish da foydalaniladigan mikoorganizmlarning faoliyati va biologik xususiyatlarini oʻrganadi.
Sanitariya Mikrobiologiyasining vazifasi suv, havo, oziq-ovqatlar sifatini nazorat qilish, kasallik tugʻdiruvchi mikroorganizmlar tarqalishining oldini olishdan iborat.
Umumiy Mikrobiologiya mikroorganizmlar morfologiyasi, fiziologiyasi, biokimyosi, genetikasi, sistematikasi va ularning tabiatdagi ahamiyatini oʻrganadi. Yashash muhitiga koʻra umumiy Mikrobiologiya tuproq, sanoat, suv, geologik, kosmik Mikrobiologiyaga ajratiladi.
Tuproq, yaʼni qishloq xoʻjaligi mikrobiologiyasi tuproq mikroorganizmlari tarkibini, ularning oʻsimliklar qoldigʻini oʻzlashtirishda va oʻsimliklar paraziti sifatidagi ahamiyatini oʻrgatadi. Ekinlarning mikroorganizmlar paydo qiladigan kasalliklariga, qishloq xoʻjaligi zararkunandalariga qarshi kurashning mikrobiologik usullarini ishlab chiqadi.
Geologik Mikrobiologiya mikroorganizmlarning geokimyoviy jarayonlardagi ahamiyatini oʻrganadi.
Suv Mikrobiologiyasi shoʻr va chuchuk suv mikroflorasining son va sifat tarkibini oʻrganadi, ichiladigan suvning sifatini nazorat qiladi.
1965-yildan kosmik Mikrobiologiya rivojlana boshladi. U bir hujayrali organizmlarning kosmik fazodagi hayot faoliyatini oʻrganmoqda.

Zamonaviy virusologiya – fanning mustaqil yo‘nalishi bo‘lib, o‘zining tekshirish usullari va maxsus masalalariga ega, ularning yechimi virusologik laboratoriyalar va institutlarda amalga oshiriladi.Fitopatogen viruslar simptomlari, indikator o‘simliklar vositasida viruslarni tadqiq qilish usullari, viruslarni tozalashning molekulyar virusologiyada ishlatiladigan har xil usullari, virus, uning oqsili va nuklein kislotalarini ajratish usullari, hamda viruslarni diagnostika qilishda ishlatiladigan tezkor va sezgir usullari haqida nazariy va amaliy ma’lumotlar berilgan.

Virus ajratish va tozalash metodlarini shartli ravishda ikki guruhga:

kimyoviy va fizik - kimyoviy metodlar

Viruslarni tozalashning kimyoviy usullari

Bu usullarni qo‘llaganda virus kimyoviy moddalar (etanol, ammoniy sulfati, polietilenglikol) bilan cho‘ktiriladi. Bu guruhga yana tozalash jarayonida aralashmaga fermentlar bilan ishlov berish (hujayra qismlarini fermentlar bilan parchalash) kiradi. Ammoniy sulfati bilan cho‘ktirish ikki bosqichda o‘tkaziladi:

1. Virus ekstraktiga faqat hujayra qismlarigina cho‘kadigan miqdordagi tuz solinadi va uni sentrifugalash bilan ajratib tashlanadi.So‘ngra cho‘kma usti suyuqligiga yuqori konsentratsiyadagi (25 - 30%) ammoniy sulfati qo‘shiladi. Hosil bo‘lgan virus cho‘kmasi sentrifugalanib ajratib olinadi. Bu usulni bir necha marta qaytarilib toza virus preparati olinadi. Metodni faqat yuqori konsentratsiyadagi tuzga chidamli bo‘lgan viruslar uchun qo‘llaniladi. Kimyoviy metodni qo‘llaganda ko‘pgina beqaror (labil) viruslar tozalash jarayonida faolligini yo‘qotadi yoki parchalanadi, chunki kimyoviy moddalarni qo‘llaganda ular virusni denaturatsiyaga uchratadi. Agar virus fermentlar ta’siriga chidamli bo‘lsa, u holda virus suspenziyasi proteoletik fermentlar yoki nukleazalar bilan ishlov berilib, hujayra oqsillarini va nuklein kislotalarini mayda molekulali birikmalargacha parchalanadi. So‘ngra virus ekstraktini boshqa metodlar qo‘llab tozalanadi.

Viruslarni ajratish va tozalashning fizik-kimyoviy metodlari.

Bu metodlarni qo‘llaganda virus va hujayra qismlari fizik - kimyoviy xususiyatlariga qarab ma’lum fraksiyalarga ajraladi.Hamma fizik-kimyoviy metodlarni qo‘llaganda virus o‘zining birlamchi xususiyatlarini saqlab qolgan bo‘lishi kerak. Fizik-kimyoviy usullarning viruslarga bo‘lgan ta’siriga qarab "ayovsiz" (jyostkiy) va "ehtiyotkor" (shadyashiy) metodlarga bo‘linadi.

1."Ayovsiz" virus ajratish usullari qo‘llanilganda virusli ekstraktga issiqlik ta’sir ettirilganda ham, virus "nativ" (o‘zgarmagan holda) holatda bo‘ladi yoki virusli ekstraktni muzlatib normal hujayra qismlarini denaturatsiyalanadi. Tozalashning bu usulini qo‘llaganda issiqlikga yoki muzlatishga chidamsiz bo‘lgan hujayra qismlari denaturatsiyalanadi va cho‘kmaga tushadi. Bu usulni boshqa metodlar bilan birgalikda qo‘llab, toza virus preparatini olish mumkin. Mazkur metodlar termostabil va muzlatishga chidamli viruslar uchun qo‘llaniladi. "Beayov" virus tozalash metodlariga yana ikki faza chegarasida sirtqi denaturatsiyalash metodi ham kiradi. Masalan, "suv-havo", "suv – qutbsiz modda, suv - qattiq modda kabi ikki modda fazalari chegarasida hujayra qismlari oson denaturatsiyalanadi. Oqsillarni sirt denaturatsiya qilish uchun ular orasidan havo pufakchalarini o‘tkazib yoki xloroform va benzol bilan emulsiyalash mumkin. Bu usul qo‘llanilganda bir qism hujayra oqsillari denaturatsiyalanadi va erimaydigan holatga o‘tadi. So‘ngra ularni sentrifugalab yo‘qotiladi. Albatta bu metod ham sirt denaturatsiyaga chidamli bo‘lgan viruslar uchun qo‘llaniladi.

2.Viruslarni tozalashni "ayovchi" fizik-kimyoviy metodlariga gel xromatografiyasi, xromatografiya, sentrifugalash, elektroforez va hokazolar kiradi. Bu usullar ko‘llanilganda virus virusli ekstraktdan fraksiyalarga ajratilgan holda olinadi.Viruslarni ion almashish va adsorbsion xromotografiya metodlarida tozalash virus va hujayra qismlarini sirtqi zaryadlarini farqlariga asoslangan. Viruslarni defferensial sentrifugalash usulida tozalaganda ikki vazifa bir yo‘la bajarilishi mumkin: virus konsentatsiyasi oshadi (quyuqlashadi) va u yana hujayra qismlaridan ozod bo‘ladi. Bu usul eng ishonchli virus tozalash metodidir. Tiniqlashtirilgan virusli eritma 1 daqiqada 20 - 50 ming marta aylanish tezligida ultratsentrifuga qilinadi. Virus va u kabi hujayraning yirik tarkibiy qismlari probirka tagiga cho‘kadi. Cho‘kma virusga mos buferda eritiladi. Yirik virus bo‘lmagan qismlarni 8—15 ming marta aylanish tezligida sentrifugalanadi. Cho‘kma usti suyuqligi 20 — 50 ming marta aylanish tezligida yana sentrifugalanadi va cho‘kma ustida qolgan kichik malekulali qismlardan ajratiladi. Uch-to‘rt sikl differensial sentrifugalash toza virus preparatini olish uchun yetarli hisoblanadi. Viruslarni saxarozaning har xil konsentratsiyali gradiyentida va og‘ir metallar tuzlarini (seziy xlor, seziy sulfat) gradiyent zichligida sentrifugalab toza preparat olish mumkin.Virus zarralari va boshqa qismlarini sentrifugalash jaraѐnida gradiyent bo‘yicha joylashishi ularning o‘lchami, shakli va zichligiga bog‘liq bo‘ladi.

Viruslarni "izoelektrik pretsipitatsiya" metodida tozalaganda eritma рН ni virus izoelektrik nuqtasigacha o‘zgartirilganda virus cho‘kmaga tushadi. Bunda virus IEN dan farqlanadigan bir qism "normal hujayra qismlari" eritmada qoladi. Cho‘kmaga tushgan virus mo‘tadil sentrifugalash bilan ajratib olinadi va o‘ziga mos buferda eritiladi. Izoelektrik nuqtada cho‘ktirish siklini (IEN cho‘ktirish, eritish va sentrifugalash) bir necha marta qaytarib, ancha toza virus preparatini olish mumkin.Viruslarni ajratishda preparativ elektroforez metodi ham ishlatiladi. Bu metodda virus zarralari va hujayra qismlari sirtqi zaryadlarini farqlariga qarab ajratiladi.

Gradiyent zichlikda elektroforez olib borilganda konsentratsiyasi yuqori virus saxaroza gradiyenti solingan kolonkaga solinadi va elektroforez o‘tkaziladi. Saxaroza o‘rniga boshqa gellar (kraxmal, agar, agaroza, jelatina, poliakrilamid) ishlatilishi ham mumkin.Shunday qilib, yuqorida bir necha xil virus tozalash metodlariga qisqacha tavsif berildi. Yuqorida ta’riflangan metodlardan eng afzallaridan modda gradiyentida sentrifugalashni aytish mumkin, chunki bu holatda virus doimo eritmada bo‘ladi. Preparativ elektroforezda ham virus eritmada bo‘lsa ham elektroforez davomida u qizishi mumkin.TMV ning differensial sentrifugalash metodi bilan tozapreparatini olishSentrifuganing yaxshilab yuvib quritilgan probirkalariga virusli eritma (Yuqorida berilgan "namuna tayyorlash" bo‘limiga qaralsin) quyiladi, so‘ngra probirkalar tarozi ѐrdamida tenglashtiriladi va qopqoqlar avval qo‘l bilan, so‘ngra maxsus "kalit -moslama" bilan ѐpiladi. Probirkalarning tengligi qayta torozida tekshiriladi, so‘ngra burama qopqoqlari bilan germetik ѐpiladi (agar probirkalarning biri og‘irroqt bo‘lsa, barobarlashtirish uchun shprits ѐrdamida eritmadan qo‘shiladi). Probirkalar sentrifugani rotoriga bir-biriga qarama-qarshi qilib qo‘yiladi. Rotor zich qilib rotor qopqog‘i bilan ѐpiladi va ultratsentrifuga kamerasiga joylashtiriladi (ultratsentrifuga rotorini o‘rnatish va sentrifugani ishlatish maxsus operator tomonidan. bajariladi). Sentrifugalash 90 minut davomida 105 000 g da bajariladi.Ultratsentrifuga aylanishdan to‘xtagandan so‘ng, rotordan probirkalarni chiqarib olinadi, probirkaning eng tagida ozgina jigarrang virus cho‘kmasi va undan to‘la ajralgan cho‘kma usti suyuqligi kuzatiladi.Cho‘kma usti suyuqligini to‘kib tashlanadi, virus cho‘kmasini esa ozgina 0,01 M tris - HCl buferida (rN-7,6) eritiladi. Agar virus yaxshi tozalangan bo‘lsa oq -havorang "opalessensiya" kuzatiladi. Eritmani 15-18 ming ayl. tezligida sentrifugalanadi va erimagan qismidan ajratiladi. Erimagan cho‘kmani yana bir marta 1-2 ml bufer bilai eritib, cho‘ktirib, cho‘kmausti suyuqligini asosiy virus eritmasiga qo‘shiladi va saqlanadi.Shu differensial sentrifugalash siklini 3 - 4 marta qaytarib yetarlicha tozalangan virus preparati olinadi.

Viruslarning o‘lchamlari (18-600 nm) va zichliklari shundayki, agar ularga markazdan qochma kuchni 30000 dan 200000 g ta’sir ettirilsa, virus zarralari cho‘kmaga tushadi. Shu maqsadda preparativ ultratsentrifugalarning rotorlarini minutiga 50000 — 60000 marta aylanadigan sentrifugalari ishlatiladi. Eng mashhurlaridan Hitachi MSE firmasining Spinco L 2 va Spinco L 50, Super -Speed -25, Super-Speed-40, Super-Speed-50, GDR ning Vac-40, Vac -60 sentrifugalari ishlatiladi. Ular rotor to‘plamlariga ega. 1500 ml suyuqlikni 59000 da aylantiradigan rotorlardan 80 - 100 ml suyuqlikni 200000 g gacha aylantiradigan rotorlarga ega.

Differensial sentrifuga usulida virus tozalaganda virusni suspenziyadan cho‘ktiriladi, boshqatdan suspenziya holatiga o‘tkaziladi, sovuqda magnit aylantirgichida chayqatiladi hamda past tezlikda sentrifugalanadi (6000 g, 30 min). Bu jaraѐnni bir necha marta qaytarish mumkin. Hayvon viruslarini, bakteriofaglarni bir sikl differensial sentrifugalash bilan tozalash qiyin bo‘ladi. Bunda avval har xil usullarda__ (m., ionalmashish xromatografiyasi) virus tozalash bosqichlaridan o‘tib, virusni katta hajmli suyuqlikdan kichik hajmga o‘tkazishda ishlatilishi mumkin. O‘simlik viruslarini tozalashda bu metod yaxshi samara beradi.

Foydalanilgan adabiyotlar

1. Muhamedov E.M., Eshboev E.X. Mikrobiologiya, immunologiya, virusologiya. T.,.
Bakulina N.A., Kraeva E.L. Mikrobiologiya. T., “Meditsina” nashriyoti. 1979
2. . Vorobyov A.A., Bo`kov A.S. «Mikrobiologiya». M., izd-vo «Vo`sshaya shkola». 2003.
3. Pyatkin N.D., Krivoshein Yu.S. Mikrobiologiya va immunologiya. M., izd-vo
«Meditsina» 1980.
4. Sinyushina M.N., Samsonova M.N. Rukovodstvo k laboratorno`m zanyatiyam po mikrobiologii. M., 1981.
5. Timakov V.D., Livashev V.S., Borisov L.B. Mikrobiologiya. M., 1983. 6.Kochemasova Z.N., Efremova S.A., Nabokov Yu.S. Mikrobiologiya. M., izd-vo «Meditsina». 1984.
7.Churbanova I.N. Mikrobiologiya. M., idz-vo «Vo`sshaya shkola». 1987.