Маъруза мавзуси 10-мавзу. Секвенирлаш – днкнинг бирламчи нуклеотидлар кетма-кетлигини аниқлаш. Нуклеотидлар кетма-кетлиги асосида организмларни идентификация қилиш

ПЗР амплификацияси ассиметрик реакциялари фрагментларини тозалаш.

1. 
   ПЗР-фрагментлари сақланган пробиркага 2 мкл 125 мМ ЭДТА, 2 мкл 3М натрий ацетат ва 70 мкл 95% этанол қўшинг.
   
2. 
   Аралашмани хона шароитида 15 дақиқа мобайнида инкубация қилинг сўнгра аралашмани вортексда аралаштиринг.
   
3. 
   Аралашмани 30 дақиқа мобайнида 20°С да инкубация қилинг.
   
4. 
   20 дақиқа мобайнида 13.3 минг дақ/ай центрифугаланг.
   
5. 
   Кераксиз суюқликли микропипетка ёрдамида асталик билан олиб ташланг.
   
6. 
   Чўкиндига 100 мкл 70 % ли этанол ва 5 дақиқа мобайнида 13.3 минг дақ/ай центрифугаланг.
   
7. 
   Кераксиз суюқликли олиб ташланг ва пробиркаларни 37°С термостатда очиқ ҳолда қуритинг.
   
8. 
   Кераксиз суюқлик буғлангандан сўнг 20 мкл Hi- Di формамида қўшинг.
   
9. 
   Аралашмани 20 сек давомида вортексда аралаштиринг.
   
10. 
    Пробиркадаги аралашмани термоцеклерга жойлаштиринг.
    

• 
  2 дақика мобайнида 95° С гача қиздиринг;
  
• 
  Сақлаш учун 4° С гача совутинг.
  

11. 
    Пробалар жойлашган пробиркларни термоциклердан чиқаргандан сўнг, қисқа вақт мобайнида (20 сек) центрифугалаб, томчиларни йўқотиб олинг ва пробани маҳсус секвенерлаш учун мўлжалланган пробиркага жойлаштиринг.
    
12. 
    Секвенерлаш натижаларига BioEdit дастурлаш пакети ёрдамида ишлов берилади. Секвенланган хромотограмма таҳлили учун Chromas дастуридан фойдаланилади. Мисол тариқасида 6-расмда BioEdit дастурлаш пакети ердамида секвенланган хромотограмма таҳлили курсатилган. 18S рРНК гени қисмидаги бирламчи нуклеотидлар кетма-кетлигини (узунлиги 417 п.н.):
    

>7а
CGAGTGGCGTTTAGCCACACCAGATTGAGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTCCGGGGCCGCACGCGCGCTACACTGAAGGAATCAGCGTGGATGCCTCCCTGGCCCGAAAGGGCTGGGAAACCCGTTGAATCTCCTTCGTGCTAGGGATTGGGGCTTGTAATTCTTCCCCATGAACGAGGAATTCCCAGTAAGCGCGAGTCATAAGCTCGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTATCGATTGAGCGGTTCAGTGAGGGCCTCGGATTGGTCTCGGTCTGGTGCGCAAGTGCCGGCACCGCTGGCCGAGAAGAAGCTCGAACTCGATCGCTTGGAGAAAGTAAAAGTCGTAATAAGGTTTCCGTAGGTGAATCTGCGGAAGGATCATTA





6 расм. BioEdit дастури ёрдамида секвенс храмотограммаси намунаси.