Макарова Тамара Олеговна Изучение биологической активности пептидов слюны человека Выпускная квалификационная работа по направлению подготовки Биология, основная образовательная программа

2.4.3Оценка совместного антимикробного действия исследуемых пептидов методом серийных разведений по принципу "шахматной доски"

Метод серийного разведения по принципу «Шахматной доски» (Orhanetal., 2005) использовали для выявления синергических эффектов при исследовании совместного действия пептидов слюны.
Оценку совместного действия пептидов проводили в отношении грамотрицательной бактерии Escherichia coli ML35р и грамположительной бактерии Staphylococcus aureus SG511.
Культуру микроорганизмов в логарифмической фазе роста получали аналогично описанному выше алгоритму для метода серийных разведений. Согласно методу «шахматной доски» одно из исследуемых веществ двукратно разводиться по горизонтали, а второе по вертикали. В результате этого в каждой лунке экспериментального планшета Терасаки получают определенную комбинацию концентраций исследуемых пептидов. В данной работе проводили упрощенный эксперимент, используя для второго вещества одну концентрацию.
В лунки микрокамеры Терасаки вносили по 2 мкл соответующих разведений исследуемых веществ в в 0,01 М натрий-фосфатном буфере рН 7,4. После этого в эти лунки добавляли по 4 мкл бактериальной суспензии, таким образом, конечный объём пробы составлял 8 мкл. Начальная концентрация исследуемого пептида равнялась МИК/2, а второго была постоянной и равнялась МИК/4.
Так же как и в методе серийных разведений использовали два вида контролей среды и бактерий.
Планшеты с пробами инкубировали в термостате при 37 С в течение ночи. Результаты оценивали на следующий день, не вооруженным глазом оценивали наличие или отсутствие роста бактерий в лунках микрокамеры. Индекс фракционных ингибирующих концентрация является показателем характера совместного действия веществ (Jacobs, 1999).
иФИК = ФИК A + ФИК B = [A]/[МИК A] + [B]/[МИК B], где где [А] и [В] – концентрации веществ А и В соответственно в их смеси (комбинации), ингибирующей рост бактерии.
При иФИК ≤ 0,5, совместное действие препаратов является синергическим, иФИК=1 аддитивным ;иФИК> 2 – антагонистическим.

5. 
   Масс-спектрометрия
   

Масс-спектрометрия MALDITOF выполнялась в ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины». Данные любезно предоставлены д.х.н. Б.Л. Мильманом.