|
Рис. 2. Метод растений-
индикаторов:
а – инокуляция целого растения;
б – инокуляция отдельных листьев
индикаторных растений
29
Серологический метод
широко распространен при диагностике виру-
сов. Если теплокровному животному, например кролику, ввести в кровь
очищенный препарат растительного вируса, иммунный аппарат животного в
ответ на введение чужеродного белка (антигена) начнет вырабатывать спе-
цифичные этому белку антитела, связывающие его. С помощью специальных
методик эти антитела можно выделить из сыворотки крови и использовать
для определения вирусов непосредственно в соке растения. В последнее вре-
мя разработаны методы, которые позволяют вырабатывать антитела в культу
ре
invitro
клеток животного. В результате реакции между антителом и антиге-
ном образуется осадок (преципитат, или серум), различимый визуально или с
помощью микроскопа. В основе связи антиген – антитело лежит принцип
ключа и замка, то есть она очень специфична. Каждое определение необхо-
димо проводить в присутствии соответствующего контроля.
Практическое значение для идентификации вирусов в растении имеют
следующие модификации:
капельный метод.
На предметном стекле каплю антисыворотки смеши-
вают с каплей сока растения и через несколько минут оценивают реакцию под
микроскопом при малом увеличении в темном поле или визуально без микро-
скопа. При положительной реакции заметен хлопьевидный осадок (рис. 3);
Рис. 3. Капельный метод
серологической диагностики:
слева – контроль (реакция отрицательная);
справа – хлопьевидный осадок (реакция
положительная)
метод двойной диффузии в агаровом геле
используют для определения
сферических и других мелких вирусов. При этом в одни лунки, вырезанные в
слое агара, в чашках Петри добавляют антисыворотку, а в другие – очищенный
сок растения. Антитела и вирусные частицы диффундируют в геле навстречу
друг другу и образуют в месте встречи отчетливые линии преципитации;
при использовании
метода радиальной иммунодиффузии
антисыво-
ротку добавляют непосредственно в агар, а лунки заполняют соком. При по-
ложительной реакции вокруг лунок образуются преципитаты в форме колец;
метод адсорбции
основан на том, что перед реакцией с антигеном ан-
титела связывают каким-либо инертным материалом с крупными частицами,
например латексом. При реакции с антигеном происходит хорошо заметная
агглютинация всего комплекса;
наиболее высокочувствительной, позволяющей получить количе-
ственные оценки модификацией является
иммуноферментный анализ
(ИФА),
основанный на связывании антител определенными метками – ферментами.
В лунки микроплаты из полимерных материалов добавляют антисыворотку и
очищенный сок, содержащий вирусы – антигены; между ними происходит
первая иммунная реакция. Затем на фиксированный комплекс антиген – ан-
титело наносят раствор антител, связанных ферментом (фосфатаза или пе-
роксидаза); при этом меченные ферментом антитела наслаиваются на детер-
минанты молекул антигена и начинается вторая иммунная реакция. После
добавления соответствующего ферментного субстрата происходит фермент-
30
ная реакция по каталитическому расщеплению субстрата, что обнаруживает-
ся с помощью фотометра по цветной реакции.
Метод электронной микроскопии
дает возможность быстро получить
информацию о наличии вирусных частиц в растении. С помощью электрон-
ных микроскопов на ультратонких срезах пораженных частей растений мож-
но установить форму, строение и даже размеры вирусов. Трансмиссионный
электронный микроскоп используют для серийных анализов вирусной ин-
фекции в соке растений. С помощью иммуноэлектронной микроскопии мож-
но обнаруживать вирусные частицы с наслоившимися антителами.
Метод гель-электрофореза
основан на электрофоретическом разделе-
нии предварительно очищенных нуклеиновых кислот вируса (вироида) или
его белкового компонента в полиакриламидном геле при силе тока 3 и 6 мА с
последующим окрашиванием красителем зон соответственно нуклеиновых
кислот или белков. При сравнении высоты полученных окрашенных линий с
высотой стандартных, или маркерных, зон определяют массу (соответствен-
но и размеры) вирусных структур.
Молекулярно-генетические методы
основаны на знании строения мо-
лекулы РНК вируса или вироида. Отличаются высокой надежностью, чув-
ствительностью, быстротой. К недостаткам этих методов относятся высокая
стоимость реактивов и оборудования для проведения диагностики, а также
необходимость предварительного изучения генетических кодов патогенов.
Наиболее распространенный тест – амплификация (умножение) видо-
специфичных последовательностей РНК при
полимеразной цепной реакции
(ПЦР), в ходе которой отдельные химически синтезированные фрагменты
РНК (праймеры), характерные только для одного вида или рода вирусов,
участвуют в ферментативном воспроизведении соответствующих участков
матричной РНК, выделенной из зараженного растения. Продукты ПЦР с по-
мощью ферментов многократно клонируют (амплифицируют) при опреде-
ленных режимах температур в циклическом термостате, при этом исходное
число копий выбранного фрагмента РНК возрастает в миллионы раз. Затем
их обнаруживают методом гель-электрофореза или иммунофлуоресценции.
Несмотря на сложность и дороговизну, ПЦР-диагностика – перспективный
метод, в десятки раз более чувствительный, чем иммунохимические методы.
Он позволяет выявлять и идентифицировать новые вирусы и их штаммы.
Метод ДНК-зондов –
другая модификация молекулярно-биологичес-
кого метода, также основана на принципе комплементарности видоспеци-
фичных последовательностей нуклеиновых кислот. Синтезируют зонды, ко-
торые «узнают» определенные нуклеотидные последовательности РНК виру-
са. В зависимости от выбора зондов можно дифференцировать роды, виды и
штаммы вирусов.
К
методу пересадки
растений на другой участок прибегают для под-
тверждения или опровержения вирусной природы заболевания. Например,
для определения причин хлороза растений их можно пересадить на заведомо
благоприятную почву. Если заболевание неинфекционное, то через некото-
рое время у растений восстановится типичная зеленая окраска. При вирусном
заболевании хлороз сохранится.
Метод включений
– один из самых простых методов, не требующих
дорогостоящего оборудования. Развитие некоторых вирусов в клетках расте-
31
ния сопровождается образованием в них скопления вирусных частиц (вклю-
чений, или кристаллов Ивановского), которые обнаруживаются с помощью
обычного светового микроскопа. Каждому виду вируса свойственна своя
форма вирусных включений, образующихся обычно в клетках волосков или
эпидермиса листьев. Например, для вируса табачной мозаики характерны иг-
ловидные и гексагональные кристаллы; для Х-вируса картофеля и вируса мо-
заики пшеницы типично образование сферических аморфных тел.
Для выявления зеленой крапчатой мозаики огурца, скручивания листь-
ев картофеля и некоторых других болезней применяют химические аналити-
ческие методы диагностики в пораженных тканях растений.
Do'stlaringiz bilan baham: |
