Лабораторные работы по предмету микробиология, вирусология и иммунология

Методы индикации вирусов.
Индикацию вирусов можно проводить по их цитопатогеныому действию (ЦПД) на культуру клеток. Это действие выражается в повреждении монослоя за­раженной культуры клеток и изменении их морфологии (дегенерация). При этом клетки округляются, темнеют, теряют отростки, в них появляется зернистость. Возможно образование многоядерных клеток (симпласт), в частности, под действием респираторно-синцитиального вируса. В дальнейшем происходит отслойка клеток от стекла - нарушение монослоя.
Индикация вирусов с помощью реакции гемадсорбции (РГад).Сущность этой реакции заключается в способности эритроцитов человека или животных адсорбироваться на поверхности клеток, инфицированных рядом вирусов (например, орто и парамиксовирусов и др.) в ранние сроки их репродукции (до развития ЦПД) в результате действия гемагглютининов – гликопротеидов, входящих в состав суперкапсида вируса. Для постановки РГад в культуру клеток добавляют 0,2 мл 0,5%-й взвеси эритроцитов, выдерживают 15-20 мин при температуре 4⁰, 20⁰ или 37⁰ С в зависимости от свойств вируса, после чего взвесь эритроцитов удаляют и производят учет реакции под малым увеличе­нием микроскопа по скоплению эритроцитов на отдельных клетках или на всем монослое.
Индикация вирусов по цветной пробе.Принцип метода основан на определении кислых продуктов метаболизма, накаливающихся в клетке в процессе ее жизнедеятельности с помощью индикатора фенолового красного, меняющего свой цвет с красного в щелочной среде на оранжево-желтый в кислой среде. При заражении культуры клеток вирусами, вызывающими ЦПД (например, аденовирусы, энтеровирусы и др.), ме­таболизм клеток подавляется, рН среды не меняется и она остается окрашенной в красный цвет.
Индикация вирусов по внутриклеточным включениям.Репродукция некоторых вирусов (оспы, герпеса, бешенства) приводит к образованию внутриклеточных включений, локализующихся в цитоплазме или в ядре клеток и представляющих собой скопления вируса (или его антигенов). Включения выявляют путем световой микроскопии культур клеток, окрашенных по Романовскому-Гимзе или другими методами, а также с помощью прямого флюорохромирования (например акридиновым оранжевым) с последующей микроскопией препаратов в люминесцентном микроскопе.
Индикация вирусов с помощью прямой РИФ –выявлениевирусных антигенов, находящихся в инфицированной клетке культуры ткани, с помощью антител диа¬гностической иммунной сыворотки, специфических иммуноглобулинов или моноклональных антител, меченых флюорохромом, обычно флюоресцеином.
Индикация вирусов с помощью электронно-микроскопического метода (ЭММ)применяется, в основном, в научных исследованиях. Материал для ЭММ концентрируют различными методами (ультрацентрифугирование, хроматография на колонках, адсорбцией с помощью специальных сорбентов или антител – для метода иммунной электронной микроскопии). ЭММ позволяет обнаружить в ядре или цитоплазме клеток отдельные вирионы, а также их скопления. В практических целях ЭММ может быть полезен для индикации и идентификации вирусов с типичной морфологией (оспенные вирусы, ротавирусы, коронавирусы, ВИЧ и т.д.).
Индикация вирусов по образованию бляшек - очагов разрушенных вирусом монослоя культуры клеток под агаровым покрытием. Количество бляшек отражает инфекционную активность вируса.
Для постановки этой пробы вирусную суспензию в разных разведениях вносят в культуры ткани, находящиеся в плоских сосудах, после чего монослойклеток заливают гелем (слой агара или бентонита с индикатором нейтральным красным). Время бляшкообразования для большинства вирусов, обладающих ЦПД, варьирует от 36 до 48 ч. Бляшки выглядят в виде неокрашенных светлых пятен на розово-красном фоне окрашенного монослоя. В бентонитовом методе монослой клеток молочного цвета, бляшки прозрачные.
Индикация вирусов в куриных эмбрионах.Зараженные РКЭ инкубируют в термостате при 35- 370 С в течение 48 -72 ч., после чего производят их вскрытие, амниотическую и аллантоисную жидкость отсасывают шприцем, а оболочки и эмбрион извлекают и помещают в стерильные чашки Петри.
При репродукции некоторых вирусов (натуральной оспы, осповакцины, простого герпеса) на ХАО куриных эмбрионах появляются характерные бляшки - беловатые пятна диаметром 1-2 мм, количество которых соответствует числу инфекционных частиц.
В аллантоисной и амниотической жидкости зараженных эмбрионов ряд вирусов (например, ортомиксовирусы, парамиксовирусы, аденовирусы и т.д.) может быть выявлен с помощью реакция гемагглютинации (РГА). Принцип реакции состоит в способности гемагглютининов -поверхностных вирусных структур гликопротеидной природы этих вирусов склеивать (агглютинировать) эритроциты определенных видов животных, птиц или человека. РГА не относится к иммунологическим реакциям, поскольку в ее основе отсутствует взаимодействие АГ и AT.
РГА ставят обычно в пробирках или в специальных полистироловыхплан-шетах. Для этого готовят двукратные разведения вирусосодержащего материала на ФР в объеме 0,5 мл. Во все пробирки добав¬ляют 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов. В контроле к 0,5 мл ФР добавляют аналогичный объем взвеси эритроцитов. Пробы учитывают через 30-60 мин инкубации при комнатной температуре, в термостате при 370 С или в холодильнике при 40 С. Положительная реакция характеризуется выпадением осадка эритроцитов в виде «зонтика» с фестончатыми краями; при отрицательном результате эритроциты оседают в виде компактного осадка («пуговки»). Гемагглютинационный титр (максимальное разведение вирусосодержащей жидкости, вызывающее агглютинацию эритроцитов - одна гемагглютинирующая единица вируса,1 ГЕ) соответствует концентрации вируса. Агглютинацию эритроцитов могут вызывать также некоторые бактерии (стафилококки, эшерихии, сальмонеллы, шигеллы, холерный вибрион Эль-Тор), что необходимо учитывать при трактовке результатов РГА при исследовании вирус-содержащего материала, загрязненного бактериальной микрофлорой.
Определение титра вирусов можно проводить также на хорионаллантоиснойоболочке.Для этого в лунки стерильных полистироловых пластин помещают кусочки скорлупы 11-12-дневного куриного эмбриона с неповрежденной ХАО, добавляют вирусосодержащую жидкость в десятикратных разведениях на буфере, накрывают пластины фольгой и инкубируют при 35-37 0 С в течение 24-72 часов. После этого скорлупу удаляют, добавляют 0,5% взвесь куриных эритроцитов и производят учет реакции по эффекту гемагглютинации, который свидетельствует о репродукции вируса.

Рис 39. Цитопатическое влияние вирусов на клетку: а-культура
нормальной клетки, взятой из почки эмбриона обезъяны; б- вид културы из клетки, подвергшейся сложным морфологическим изменениям под влиянием вируса полиомиелита.