Курсовая работа кинетика ферментативных реакций

1.3 Влияние концентрации субстрата на кинетику реакции

Во многих случаях условие постоянства концентрации субстрата не выполняется. С одной стороны, избыток субстрата не используется в реакции in vitro с некоторыми ферментами из-за часто происходящего ингибирования ферментативной активности субстрата. В этом случае можно применять только оптимальную его концентрацию, и это не всегда обеспечивает избыток субстрата, необходимый для выполнения кинетических уравнений обсуждаемых выше механизмов. Более того, в клетке in vivo избыток субстрата, необходимый для осуществления этого условия, обычно не достигается.

В ферментативных реакциях, где субстрат не находится в избытке и, следовательно, его концентрация меняется в ходе реакции, константа диссоциации фермент-субстратного комплекса равна

K_S = ([S] ₀ – [ES] – [P]) [E]_T - [ES])/[ES]

([S]₀ – концентрация субстрата при t = 0). В этом случае начальная скорость реакции (в стационарном состоянии) определяется формулой

v= V_max [S_t] / (K_m + [S_t])

где [S_t] – концентрация субстрата в момент времени.

Тем не менее, можно написать приблизительное решение для двух случаев, когда [S]_о = [S_t]:
1) если это неравенство выполняется из-за больших значений t, т.е. когда более 5% от начальной концентрации субстрата израсходовалось за время реакции;
2) если концентрацией фермента нельзя пренебречь по сравнению с концентрацией субстрата и, таким образом, нужно принимать во внимание концентрацию фермент-субстратного комплекса.
Если t велико, а концентрация [ES] пренебрежимо мала по сравнению с [S]₀, то уравнение константы диссоциации фермент-субстратного комплекса переходит в следующее:
K_S = ([S]₀ – [P]) ([E]_T – [ES]) / [ES]

Д ля значения концентрации [S_t], которая меняется в ходе реакции, удовлетворительным приближением служит значение ([S]₀ + [S_t])/2. Так как [S_t] = [S]₀ – [Р], среднюю скорость ; можно выразить как

Подставив это выражение и приблизительное значение [S_t] в

v= V_max [S_t] / (K_m + [S_t]),

получим:

При сравнении значений, рассчитанных на основе этого приближения, со значениями, полученными из точного, проинтегрированного уравнения Михаэлиса – Ментен, оказывается, что ошибка в определении K_m составляет 1 и 4% при расходовании 30 и 50% субстрата соответственно. Следовательно, ошибка при данном приближении незначительна по сравнению с ошибкой измерения.

Когда расход субстрата не превышает 5% начальной концентрации, но концентрация фермента так велика, что [ES] по сравнению с [S]₀ нельзя не учитывать, константа диссоциации фермент-субстратного комплекса равна:

K_s = ([S]₀ – [ES]) ([E]_T – [ES]) / [ES]

Его решение относительно [ES] дает

Из двух возможных решений может быть выбрано только отрицательное, так как только оно удовлетворяет начальным условиям: [ES] = 0 при [S]₀ = 0 или [Е]_T = 0. По аналогии с уравнением отношения v/V_max мы получили уравнение начальной скорости. Квадратное уравнение, полученное из уравнения константы диссоциации фермент-субстратного комплекса, найденную чуть выше, с помощью формул v = k₂ [ES] и V_max = k₂ [E]_T, можно привести к следующему виду:

[S]₀ V_max / v = K_s V_max / (V_max – v) + [E]_T

Если известно V_max можно рассчитать K_s.

Следует учесть два предельных случая. В первом случае [S]<m.

v = (V_max / K_m) [S] = k[S]

Таким образом, мы получили кажущуюся реакцию первого порядка и k=V_max/K_m – кажущуюся кинетическую константу первого порядка. Ее фактическая размерность – время ^-1, но она является комбинацией констант скорости первого и второго порядков нескольких элементарных стадий, т.е. k₁k₂[E]_T/(k_-1 + k₂). При условиях кажущегося первого порядка k является мерой прохождения реакции.

Другой предельный случай: [S] >> K_m. Здесь константа K_m ничтожно мала по сравнению с [S], и, таким образом, получаем v = V_max. [2]