Kichik plazmidalar, bakteriofaglar va kasmidalardan yot genlarni klonlashda vektor sifatida foydalanish

Gen muhandisligida qo’llaniladigan ba’zi bir restriktazalar tavsifi
1-jadval

Restriktazalar	Restriktaza olingan mikroorganizmlar	Restriktazalarning “aniqlaydigan ” va kesadigan oxirgi uchlari
Eco RI	Escherichia coli RI	-G-A-A-T-T-C- -C-T-T-A-A-G-
Hind III	Haemophilus influenzae	-A-A-G-C-T-T- -T-T-C-G-A-A-
SaI I	Streptomyces albus	-G-T-C-G-A-C- -C-A-G-C-T-G-
Bam I	Bacillus amyloliquefaciens	-G-G-A-T-C-C- -C-C-T-A-G-G-
Hpa II	Haemophiles parainfluenzae	-C-C-G-G- -G-G-C-C-
Alu I	Arthrobacter luteus	-A-G-C-T- -T-C-G-T-
Haem III	Haemophilus aeguptius	-G-G-C-C- -C-C-G-G-
Sma	Serratia marcescens SD	-C-C-C-G-G-G -G-G-G-C-C-C

Restriztaza fermenti ta’sirida uzilgan DNK molekulasi bo’laklarining oxirgi qismi bir xil bo’ladi. Shuning uchun ligaza fermenti ularga bir xilda ta’sir qilib, bu bo’laklarni va hattoki, bitta reestriktaza uzgan har xil plazmidalar DNK sining bo’laklarini ham har xil tartibda bir-biriga ulaydi. Natijada, quyidagi holatlarni kuzatish mumkin:

• 
  Plazmida DNK bo’laklari qayta tiklanganda oldingi tartibini hosil qilmaydi, ikkita DNK bo’lagi o’rtasiga boshqa organizm DNK sining bo’lagi kirib qolishi mumkin;
  
• 
  Bitta organizm DNK bo’lagi bilan ikkinchi organizm DNK sining bo’laklari ketma-ket joylashadi;
  

S. Koj va E. Chang birinchi bo’lib, har xil DNK si bo’lgan (ximer) plazmidani hosil qildilar.
Buning uchun 2 xil bakteriyadan yangi ichak va stafilokokk bakteriyalaridan foydalanildi. Ichak bakteriyasining plazmidasida (pSC 101) tetrasiklinga, (CO) stafilakokk bekteriyasining plazmidasida (RSF 1010) esa streptomiyarenga chidamlilikni yuzaga chiqaruvchi gen bor. Bu ikkala bakteriyalarning plazmidalari DNK sining bir-biriga birikishidan duragay plazmida hosil bo’lib, u endi tetrasiklinga ham streptomisinga ham chidamli bo’lib chiqdi. Bu duragay plazmidani ichak bakteriyasi huddi o’zining DNK si kabi qabul qildi. Natijada ichak bakteriyasining xususiyati o’zgarib, streptomisinga ham, tetrasiklinga ham chidamli bo’lib bo’lib qoldi. Kerakli gen ulangan vektor DNK sini hujayraga yoki organizmga o’tkazishining (transgenoz) to’rtta yo’li bor:

1. 
   Tranformasiya;
   
2. 
   Transduksiya;
   
3. 
   Soda hayvonlar va bakteriyalarning konyugasiyasi va yuqori organizmlari duraygaylash;
   
4. 
   Transgressiya – hujayraga kirgan virusning genomga birikishi va undagi genlar ta’sirining yuzaga chiqishi;
   

Viruslar bilan prokariot hujayralar orasidagi materialning ko’chirilishini, tabiiy sharoitda bakteriyalarda o’tadigan rekombinasiya mexanizmlarini o’rganish, plazmidalar va mo’tadil faglarning hujayradagi hayotini tushunish genlar ustida turli manipulyasillar o’tkazish imkonini beradi. Olimlar qo’lida DNK ning kerakli bir qismini bakteriya hujayrasiga ko’chirib o’tkazilaigan sistema-plazmidalar bor. Bunday transmissiv ko’chirib o’tkazuvchi halqali molekulyar – plazmidalar va mo’tadil viruslar vektor deb ataladi.
Gen injenerligi qisqacha qilib aytganda, genlar ustida turli manipulyasiyalar o’tkazish, ularni to’la o’rganish asosida funksional qismlariga ega bo’lish, kerakli joyidan kesish, kerakmas qismini olib tashlash kerak bo’lgan qismlarini boshqa genlardan yoki sintez yo’li bilan olib ulash va shu usulda tayyorlangan duragay yoki rekombinant geni muvofiq organizmga kiritib (masalan, odamning insulin genini mikrob hujayraga yoki sichqonning o’sish garmoni genini kalamushgsa), zarur turlarni yoki preparatlarni sintez qilish va hokazo g’oyalar va texnologiyaning yig’indisidir. Gen injenerligining poydevori recombinant DNK lar texnologiyasi. Genetik strukturalarini birga qo’shish texnologiyasi – molekulyar biologiyasining eng muhim yutuqlaridandir. Bu texnologiyadan foydalanib, zarur mahsulot (oqsil) ni kodlaydigan DNK molekulasining kichik bir qismi – genni kesib olish uning yot gen bilan kombinatsiyasini yaratish so’ngra, bu yangi genomni munosib hujayralarga kirib xo’jayin – hujayra DNK sining sintez mexanizmi yordamida ko’p martalab ko’paytirish mumkin. Gen injenerligining paydo bo’lishi DNK strukturasi, uning replikasiyasi, regulyatsiyasi, molekulaning ayrim qismlari, hatto, alohida nukleotidlarni topish mexanizmi, ayrim nuklein kislota, oqsillarni minimal miqdorda ajratib olib, uning millionlab nusxasini tayyorlash (mexanizmi) texnikasi ishlab chiqishiga bog’liq. Rekombinant molekulalar olish texnikasini takomillashtirish natijasida yangi viruslar, mikroblar, o’simliklar, hayvonlar turlarini yaratish, irsiy kasalliklarni davolash, buzilgan genlarni tuzatish, insoniyat uchun zarur genotipik konstruksiyalar tuzish imkoniyati tug’ildi. Bu sohaning to’la istiqboli rivojlanishiga ta’siri qanday bo’lishini oldindan aytish qiyin. Lekin inson qo’liga shunday qudratli qurol tekkani aniq.
Ayrim DNK molekulalari genlar bir turning ko’p nusxasini hosil qilish uchun ilgaridan hujayralarning toza liniyalarini olishda ko’pdan beri ishlatiladigan klonirlash texnikasining molekulalarga moslashtirilgan variant qo’llanadi. Hujayra liniyalarning bir xilligini klonirlash usuli bilan kuchaytirish mumkin. Klonirlash asosan mutant hujayralar olish uchun ishlatiladi. Molekulyar klonirlash DNK ning aniq bir namunasini toza holda ko’paytirishdan iborat.
Keyingi yillarda somatik hujayralarning qo’shilishiga ham erishish mumkin bo’ladi. Bunda avvalo, 2ta yadroli, bitta kombinirlangan hujayra – geterokarion mitotik bo’linib, bir yadroli duragay (gibrid) hujayra beradi. Uni klonirlash mumkin.
Bir turdan ajratib olingan DNK ni ikkinchi tur hujayrasiga bevosita kiritib, uning ekspressilasiga erishib bo’lmaydi, chunki resipient (qabul qiluvchi) tur o’zining DNK sini saqlaydigan qurolga ega. Ular modifikasiya qiladigan metilazalar va restriksiyalovchi endonukleazalardir.
DNK ni fragmentlarga kesish va uni bakteriyaga kiritish vazifasini oliy darajada bexato bajaradigan asbob tabiatning o’zida tayyor, ular bakteriyalar endonukleazalarning bir guruhi bo’lib chiqdi. Albatta bakteriya hujayrasida DNK molekulasini kerakli joyidan kesadigan fermentlar insonlar maqsadi uchun tayyorlangan emas, bu asbobni bakteriyalar o’z dushmani viruslarga qarshi kurashish uchun yaratgan.
Rekombinant molekulalarni konstruksiya qilish uchun restruksion endonukleazalardan foydalanishini birinchi bo’lib, 1972-yili Amerika olimlari Stenli Koj va Gerbert Boyer kashf etdilar.
Bu olimlar u vaqtgacha o’zlarining plazmidlart ustidagi tadqiqotlari bilan mashhur edilar. Koj va Boyer g’oyasiga muvofiq, plazmidani restriktazalarning biri yordamida kesib, DNK fragmentlarida bir zanjirli uchlar hosil qilinadi. DNK ning bu erkin uchlari yopishqoq uchlar deyiladi, chunki bu uchlarda to’latilmagan bir chiziqli nukleotidlar qatori bor. Shu restriktazaning o’zi bilan donor DNK ham fragmentlarga bo’linadi. Ularning birida bizni qizqtiradigan genni saqlaydigan uchastka ham bo’ladi. Endi mana shu fragmentlarni kesilgan plazmidalar bilan aralashtirilsa, DNK molekulasining bir zanjiri ichida restriktazalar yordamida hosil bo’lgan nukleotidlar qatori, plazmidalarning yopishqoq uchlariga komplimentlar bo’lganidan ula bilan tegishli megazalar ishtirokida kovalent bog’ orqali ulanadi. DNK xo’jayin DNK siga ulanib o’qilib ketmaydi. Buning uchun vositachi vector ishtirok etishi zarur.
Rekombinant molekulalarini yaratish uchun avvalo, zarur genning hujayra DNK sidagi o’rnini aniqlab, uni kesib olish kerak. Endi kesib olingan DNK fragmentini klonirlash va vektorga bog’lash kerak. DNK ni klonirlash turli manbalardan ajratib olingan DNK fragmentlarini plazmidiy yoki virusga kiritib so’ngra bu genetik elementlarni bakteriya yoki achitqi hujayralarida ko’paytirish usulidir. Shu usul bilan DNK ning fragmenti vektorga bog’lanadi. Vektorning asosiy xossasi shundan iboratki, u tegishli xo’jayinda avtonom repmisirlanish xususiyatiga ega. Mana shu usulda olingan ekombinirlangan molekula klonirlash uchun juda qulaydir, u resipient hujayrada bemalol ekspressiya qilinadi. Navbatdagi bosqichda plazmidiy yoki virus genomiga ulangan DNK molekulasi bakteriya yoki achitqi hujayrasiga kiritiladi. Bunday sintetik genomda bizni qiziqtirgan gen vector DNK sining ahamiyati kam ma’lum uchastkasini almashtirgan bo’ladi. Bakteriya hujayrasi tez bo’linib ko’payganidan, rekombinant DNK ham shu qadar ko’paydi va tegishli oqsil sintezini ko’p martalab tezlatadi va uni sanoat miqyosida olish imkonini beradi. Gen injenerligi yo’li bilan bir qancha zarur garmonlar, immun tanalar (insulin, o’sish garmoni, interferon immunoglobulinlar), turli dorilar muvaffaqqiyat bilan olinmoqda. Molekulyar biologiya va gen injenerligining turli tarmoqlari nihoyatda dadillik bilan rivojlanmoqda. Lekin hali hal qilinmagan fundamental ilmiy muammolar, amaliyot uchun juda muhim vazifalar ko’p. Ular orasida birinchi darajali ahamiyatga ega masala, insonning jismoniy va ruxiy holati, funksiyasi, imkoniyati boshqarilishining molekulyar asosini tushunishdilar. Endi shubha yoqki, bu sirlarning kaliti uning genomida. Mana shuning ham AQSHdagi va rivojlangan boshqa mamlakatlarda, bizning mamlakatimizda ham inson genomining to’la nukleotid qatorini o’rganishni maqsad qilib qoygan inson genomi nomli uzoq muddatga mo’ljallangan, juda qimmat turadigan favqulotda buyuk loyihani ishlashga kirishildi. Lekin bu ulkan vazifani bajarib bo’larmikin?
Ma’lumki inson genomi butun bir dunyo, uning moddiy asosini 3 mlrd. nukleotid qoldig’idan iborat va mingdan ortiq gen tashkil qiladi. Lekin shunday bo’lsa ham, molekulyar biologiya va gen injinerligining bugungi kundagi xollari: metodik va tajribasi. Bu vazifani hal qilishga qurbi yetadi, deb ishonsa bo’ladi.
Keying yillarda butun xromosomalar va ularning juda katta fragmentlarini genlardagi elektroferoz usulida ajratib olish va katta DNK molekulalarining strukturasini tez aniqlash usullari ishlab chiqildi, millionlab asosga ega bo’lgan gigant DNK larni eukariotlar hujayrasida klonirlashga erishildi.
Shuni aytib o’tish ham o’rinli: tarix shuni ko’rsatadi, insoniyat o’z oldiga doimo hal qilishi mumkin bo’lgan vazifani qo’yib kelgan.
Shubha yoqki, “odam genomi” dek mislsiz loyihani o’z oldiga qo’ygan molekulyar biologiya va gen injenerligi hujayradagi har bir genning tuzilishi, funksiyasini, xromosomada aniq joylashgan o’rnini tayinlash; ularga bog’liq belgilar, xossalar, buzg’unliklarni aniqlash asosida irsiy kasalliklar (genom kasalliklari)ning (aniqlash asosida) oldini olish va davolash turli oqsillar, fermentlar, garmonlar, vaksina va antitelalarni ishlab chiqarishh, mikroorganizmlarning yangi turlarini yaratish, o’simlik va hayvon genomiga odamlar uchun foydali xususiyat beradigan genlarni kiritish va boshqa muammolarni muvaffaqqiyatli hal qiladi (4-rasm).



4-rasm. Rekombinant DNK olish sxemasi.

REKOMBINANT DNK OLISH USULLARI

Sun’iy sharoitda rekombinant DNK olish va genlarni klonlash ilk bor 1972 yilda AQSh olimlari Boyer va Koen tomonidan amalga oshirilgan. Bu olimlar E.coli bakteriyasining xromosoma DNK siga va shu bakteriya plazmidasiga alohida idishlarda EcoRI restriktaza fermenti bilan ishlov berganlar. Plazmida tarkibida faqat 1 dona EcoRI restriktaza fermenta tanib kesadigan maxsus nukleotidlar ketma- ketligi bo’lganligi sababli ferment plazmidaning halqasimon DNK qo’sh zanjirini faqat bir joydan kesib, plazmidani «yopishqoq« uchli ochiq holatga o’tkazadi. Xromosoma DNK molekulasida EcoRI restriktaza fermenti taniy oladigan maxsus nukleotidlar ketma-ketligi qancha bo’lsa, bu molekula shuncha bo’lakka bo’linadi.
Turli xil o’lchamga ega bo’lgan DNK molekulasi elektroforez uslubi yordamida ajratib olinadi. Ajratib olingan «yopishqoq» uchli xromosoma DNK si bo’lagi ochik xolatdagi “yopishqoq” uchli plazmida DNK si bilan aralashtirilib ligaza fermenti yordamida tikiladi (ulanadi). Natijada plazmida tarkibiga xromosoma DNK bo’lagi kiritiladi. Shu boisdan rekombinant DNK ga quyidagicha tarif berish mumkin: har sanday tirik organizm irsiy molekulasining istalgan bo’lagini vektor molekulalariga birikishdan hosil bo’lgan sun’iy DNK - rekombinant DNK deyiladi.
Rekombinant DNK olishning uchta usuli mavjud:

• 
  Konnektor usuli;
  
• 
  restriktaza-ligaza;
  
• 
  linker molekulalaridan foydalanish usuli.
  

Konnektor usulida - rekombinatsiyada ishtirok etuvchi DNK bo’lagining 3' uchiga dezoksinukleotidil-transferaza fermenti yordamida ma’lum uzunlikdagi oligo (dA) - segmenti ulanadi. Ikkinchi uchiga = esa ' oligo (dT) - segmenti ulanadi. Bu DNK buo’laklari aralashtirilganda dA va dT segmentlarning vodorod bog’lari asosida komplementar birikishi tufayli halqasimon DNK sttrukturasi hosil bo’ladi. Hosil bo’lgan DNK bog’i bir zanjirli bo’sh joylar DNK-polimeraza I fermenti yordamida to’ldiriladi.
Restriktaza-ligaza usuli - rekombinant DNK olishning eng sodda va oson usuli hisoblanadi. Bu usulda DNK molekulasi va vektor plazmida «yopishqoq» uchlar hosil qiluvchi restriktaza bilan qirqiladi va aralashtirilgan holda ma’lum sharoitda reassotsiatsiya qilinadi. Komplementarlik xususiyatiga ko’ra DNK molekulalari o’zaro vodorod bog’lari yordamida birikib halqasimon struktura hosil qiladi va DNK zanjirining birikmagan joylari DNK-ligaza fermenti yordamida ulanadi.
Linker molekulalaridan foydalanish usulida - DNK molekulasiga va vektor plazmidaga T4 fag DNK-ligaza fermenti yordamida maxsus nukleotid ketma-ketligiga ega bo’lgan linker molekula ulanadi. Olingan ikki turdagi DNK molekulasi restriktaza fermenti yordamida qirqilib, aralashtirilgan holda qaytadan assotsiatsiya silinadi. DNK va vektor plazmida molekulalarining birikmagan joylari DNK-ligaza fermenti yordamida ulanadi. SHu yo’sinda rekombinant DNK molekulasi hosil bo’ladi.