Ishning asosiy mazmuni

ISHNING ASOSIY MAZMUNI

Tadqiqotning obyekti va metodi usullari

2001-2003 yillarda Samara viloyatida, 2004-2008 yillarda Moskva viloyatining VILAR botanika bog'ida meva pishib va to'kilishi natijasida yerdan to'plangan oddiy oddiy ot kashtan - Aesculus hippocastanum L urug'larining tajriba to'plamlari namunalari sifatida o’rganildi. Tajribalarda maydalangan xom -ashyolardan foydalanilgan. Tegirmonda xom ashyoni maydalash ishlari MIR-1 o'simlik materialinieksperimental maydalagichi tomonidan olib borildi - (nominal aylanish tezligi 3000, unumdorligi 40 kg / soat). Ezilgan urug'lar TU 23.2.2068-89 bo'yicha o'lchamlari 0,5 va 3 mm bo'lgan teshiklari bo'lgan elakdan o'tkazildi. Global Fund XI talablariga muvofiq tovarlar tahlili o'tkazildi.

JIPCdan namuna olish va tahlil qilish GF XI usullari va biz ishlab chiqqan TG ni sifatli va miqdoriy aniqlash usullariga muvofiq amalga oshirildi. Umumiy va yer osti xom ashyolarining mikroskopik tahlili "Dorivor o'simlik materiallarini mikroskopik va mikrokimyoviy tadqiq qilish texnikasi" umumiy farmakopoeal maqolasiga muvofiq amalga oshirildi. Ot kashtan urug'larining kesma qismlari slayd mikrotomida qilingan, Axiocam HRc kamerasi Axiolmager Ml mikroskopi bilan (2,5x linzalar - EU Plann-Neofluar) mikrofotografiya qilingan.

Biologik faol moddalarni olish va xromatografik tizimlarni tayyorlash uchun "h" va "hch" markalaridagi erituvchilar ishlatilgan. Ishning eksperimental qismida ishlatiladigan reaktivlarni tayyorlash GFH 1 va 2 soniga muvofiq amalga oshirildi. Ekstraktlarni konsentratsiyalash va erituvchilar distillash IR-1M markali vakuumli bug'lantiruvchi aylanadigan evaporatatorda amalga oshirildi.

Yupqa qatlamli xromatografiya (TLC) Sorbfil PTSX-P-A-UV (Rossiya) 15x15 o'lchamdagi va Silufol UV 254 (Chexiya) 10-10 sm o'lchamda, (19-23) ° C haroratda germetik yopiq holda vertikal shisha kameralarda o'tkazilgan. O'rganilgan eritmalarning xromatografik plitalarga qo'llanilishi Gamilton shpritsi (10 mkl) yordamida amalga oshirildi. TLC uchun erituvchi tizim ishlatilgan: izopropanol-etil asetat-suv (40:40:30) va xloroform-metanol-suv (26: 14: 3). Erituvchilarning nisbati hajm qismlarida hisobga olingan. Xromatogrammalarni quritgandan so'ng, xromatogrammalarni o-fosforik volfram kislotasining 25% alkogolli eritmasi bilan, so'ngra 110 ° C da qizdirilgan va diazobenziyali karbonat angidridli karbonat kislotasi eritmasi bilan ishlov berishdan oldin xromatogrammalarni quritgandan so'ng triterpen glikozidlari, flavonoidlar va kumarinlarning adsorbsion zonalari UV nurlari bilan aniqlanadi (254 va 366 nm). R_f aralashmalarining barcha qiymatlari beshta o'lchovlarning o'rtacha qiymati sifatida hisoblanadi.

Yuqori samarali suyuq ALS urug'lari xromatografiyasi va ot kashtan urug'i ekstrakti. HPLC tomonidan sifatli va miqdoriy tahlil qilish usullarini ishlab chiqish uchun Agilent 1100 seriyali qurilma (AQSh) diodli massivda ultrabinafsha nurli spektrli detektor bilan, ma'lumotlarini yig'ish va qayta ishlash uchun kompyuter tizimidan foydalanildi. A. 09.03 [1417], Agilent. Statsionar faza sifatida simmetriyasi C18 sorbenti (AQSh) bilan to'ldirilgan 250x4,6 mm suvli xromatografik ustun ishlatilgan. Ko'chma faza sifatida erituvchi tizimdan foydalanilgan: gradient elutatsiyasi sharoitida fosforik kislotaning (pH = 2,5) bufer eritmasi - atsetonitril. O'rganilayotgan birikmalarni spektrofotometrik tahlil qilish uchun biz to'lqin uzunligi 190 nm dan 1100 nm gacha bo'lgan GBC UV ko'rinadigan Cintra 6 Spektrofotometridan (Avstraliya) spektrofotometrni ishlatdik. Aniqlanish 210 nm to'lqin uzunligida UV nurlari detektori yordamida amalga oshirildi.

Uslublarni ishlab chiqishda va standart namunalar sifatida indikator tarkibiy qismlari tarkibidagi tahliliy tadqiqotlarni o'tkazishda biz xromatografik jihatdan toza individual moddalar va standartlardan foydalandik: eskulin kategoriya. № 0205885 Indofin, fraksin kategoriya. № 03052603 Sigma; rutin - FS 42-2508-87 bo'yicha SO, E1378-1 Sigma escin.

Polisaxarid tarkibi gravimetrik usul bilan aniqlandi. HPLC yordamida urug'larning mono va disakaridlari va oddiy ot kashtanining quruq ekstrakti tarkibi o'rganildi. "Agilent 1100 seriyali" (AQSh) suyuq xromatografi, ChemStation, Agilent kompyuter tizimi bilan SDM. Statsionar faza sifatida Kromasil 5_c NH₂ sorbent (AQSh) bilan to'ldirilgan 200 x 2,1 mm xromatografik ustun ishlatilgan; ko'chma faza asetonitril-suv (77.23), harakatlanish fazasining tezligi - 1,0 ml / min., injektorga 10 mkl Merk L 7490 refraktometrik detektori (Germaniya) ishlatilgan.

Ot kashtaniga asoslangan urug'larning aminokislotalar tarkibi va quruq ekstrakti Agilent 1100 suyuq xromatografi (AQSh) yordamida yuqori bosimli gradient nasosi yordamida erituvchi ta'minoti 0,1 dan 5,0 ml / min gacha, va florimetrik detektori, avtosampler bilan jihozlangan ChemStation, Agilent tomonidan o’tkazilgan. Statsionar fazaning bir qismi sifatida Gipersil AA-ODS 5_c sorbent (AQSh) bilan to'ldirilgan Agilent 200x2.1mm xromatografiya ustunidan foydalanilgan. Urug'li lipidlarning guruh tarkibini aniqlash TCX usuli bilan amalga oshirildi. Alohida lipid guruhlarini miqdoriy aniqlash “Chromoskan 200” asbobida densitometrik usul bilan amalga oshirildi. Urug'larning lipofil fraksiyasi va ot kashtan urug'larining quruq ekstrakti GLC tomonidan Carlo Erba Strumentazione, HRGC 5300, Mega Series (Italiya) asbobida Windows xromatografik ma'lumotlarini olish va qayta ishlash uchun Multichrom yordamida yordamida olov ionlash detektori yordamida o'rganildi. Yuqori yog' kislotalarining metil esterlari tahlili Chrompack Capillary 7420 100x0.25 mm ustunida, ustun haroratida termostati: 110 ° C (10 min), 5 ° / min - 175 ° C (15 min), 4 / min - 200 ° C (5 min), 3 ° / min - 225 ° C (60 min), detektor harorati 240 ° C va injektor harorati 260 ° C. Tashuvchi gaz azotdir, eluentning oqim tezligi 1 ml / min. Alohida yog 'kislotalari miqdorini miqdoriy tahlil qilish C-R6A Chromatopac Shimadzu kompaniyasining integratorida aniqlandi. Hisoblash ichki normallashtirish usuli bilan amalga oshirildi.

O'rganilayotgan ob'ektlarning makro- va mikroelementlar tarkibi, shu jumladan mikro elementlar, emissiya spektral analizi usuli bilan tekis diffraksion panjara bilan DFS-8 spektrografida aniqlandi.

Quruq ekstrakti olish usulini ishlab chiqish VILAR fitokimyo laboratoriyasida olib borildi. VILAR tibbiyot bo'limida ot kashtanining quruq ekstrakti oddiy urug'larini farmakologik tadqiqotlar o'tkazildi. Hisoblash uchun ishlab chiqilgan HPLC usullari tasdiqlandi (yaroqlilikni baholash). Shu maqsadda, GOST R ISO 5725-1-2002 va Umumiy Farmakopeyani tasdiqlash loyihasiga muvofiq yetarlicha aniqlik, (takrorlanuvchanlik), chiziqlilik va o'ziga xosliklarga ega bo'lgan natijalarni olish uchun ularning yaroqliligini eksperimental ravishda isbotlab berish amalga oshirildi. Miqdoriy aniqlash natijalarini statistik qayta ishlash Global Jamg'arma XI talablariga muvofiq amalga oshirildi. (1-son, 199-207-betlar).

Ot kashtan urug'lari sifatini nazorat qilish usullarini takomillashtirish

1996 yil qayta ko'rib chiqilgan "Ot kashtan urug'lari" texnik xususiyatlari. Birinchi marta maydalangan xom ashyolarga bo'lgan talablar yangi spetsifikatsiyalarda keltirilgan, to'liq xom ashyoning ba'zi xususiyatlari aniqlangan va ushbu xom ashyoning sifatini nazorat qilishning zamonaviy usullari kiritilgan.

Urug'larning morfologik va mikroskopik xususiyatlarini o'rganish

Ekstraktni tayyorlashda ishlatiladigan eksperimental partiyalar namunalarining morfologik xususiyatlarini o'rganish asosida "ot kashtan oddiy urug'lari" tashqi belgilarining tavsifi tuzilgan.

Mavjud adabiyotlarda urug'larning massasi haqida hech qanday ma'lumot yo'q edi. Ekstraktni tayyorlash uchun ishlatiladigan ot kashtan urug'lari turli xil massaviy qiymatga ega edi. Urug'ning o'rtacha vazni 7,0 ± 3,0 g.ni tashkil qildi. Ushbu o'lchamdagi va og'irlikdagi urug'lar uchun urug'larni rasmiy Semina morfologik guruhidan rasmiy o'simlik materiallari orasidan tanlash alohida texnikani talab qiladi. Shunga asoslanib, texnik xususiyatlar mikrobiologik va radionuklidlarning tozaligini aniqlash uchun analitik namunalarning massalarini o'z ichiga oladi. Birinchi marta ot kashtan urug'larini namunaviy tayyorlash tavsifi TUga kiritildi.

Anatomik tuzilishdagi diagnostik belgilarni aniqlash uchun butun urug'larni mikroskopik o'rganish o'tkazildi, bu asl mikrofotograflar tomonidan tasdiqlangan. Urug'larning kesishishini mikropreparatlarida yuqori epidermisning palisadaga o'xshash hujayralardan tashkil topganligini ko'rish kerak, ularning devorlari g'ovak tubulalari orqali kirib boradi; hujayralarning tashqi devorlari lateral devorlarga qaraganda quyuqroq qalinlashadi. Epidermisning tepasida ingichka katikul qatlami yotadi. Urug 'po'stining asosiy qismi qalinlashgan devorlari bo'lgan hujayralardan parenximali to'qima bilan ifodalanadi. Tashqi qatorlarning hujayralari zich yopilgan, chuqurlari esa har xil shakldagi yirik hujayralararo bo'shliqlarga ega (bo'sh parenxima). Embrion yo'nalishi bo'yicha parenxima hujayralari kichrayib, siqilib, o'tkazuvchan to'plamlar joylashgan siqilgan hujayralar qatlamini hosil qiladi. Chuqur - yupqa devorlar va to'q jigarrang tarkibga ega 4-5 ta yirik cho'zilgan parenxima hujayralari qatlami. Urug 'po'stining ichki qatlami (endospermaning qolgan qismi) deformatsiyalangan hujayralar ingichka plyonka shaklida. Kotletonlarning epidermisi mayda hujayralardan iborat, kotletonlarning to'qimasi ko'pburchak zich yopiq parenximal hujayralardan iborat bo'lib, ular tarkibida yog' va kraxmalli donalar bor. Noyob nok shaklidagi yirik kraxmalli donalar, mayda donalar esa oddiy va ikki-uchta murakkab donalardan iborat.

Oddiy quruq ekstrakli ot kashtanini ishlab chiqarish uchun xom ashyo bu o'simlikning ezilgan urug'lari.

Oddiy ot kashtan ezilgan urug'larining mikroskopiya yordamida haqiqiyligini aniqlash uchun biz mikropreparatlar tayyorlashning bir necha usullarini o'rganib chiqdik. Ulardan biri mikroskop ostida ezilgan xom ashyo (eng katta xom ashyoni tahlil qilish usuliga o'xshash) topilgan eng katta urug'larning kesishmasini o'rganish. Bunday holda, mikropreparat yuqorida keltirilgan tavsiflarga mos kelishi kerak. Global Jamg'arma XI tomonidan LRS mikroskopik va mikrokimyoviy tadqiqotlar uchun tavsiya etilgan ikkinchi usul, maydalangan urug'larning analitik namunalari orasida eng katta bo'laklarning tashqi va ichki qismlarini qirqishni o'rganishni o'z ichiga oladi. Xloral gidrat yoki glitserin eritmasidagi parchalanadigan kukunning mikropreparatini ko'rib chiqishda, to'qimalar parenximasi hujayralari, to'plamlar, kotletonlarning endospermi va epidermisi, kraxmal donalari, yog 'tomchilari, hujayralararo hujayralar parenximasining parchalari ko'rinishi kerak.

Otlangan kashtan urug'larining tarqoq tarkibini tahlil qilish shuni ko'rsatdiki, elakdan 0,25 mm diametrli teshikdan o'tadigan zarrachalar ulushi 11% ni tashkil qiladi. Uchinchi usul, maydalangan ot kashtan xom ashyosining haqiqiyligini mikroskopiya yordamida aniqlash uchun ushbu aniq fraktsiya zarralaridan mikropreparat tayyorlashga asoslangan.

Shakl 1. maydalangan ot kashtan urug'larining mikropreparatlari 1 - qobiq yuzasidan epidermal hujayralar (uv.x 200); 2 - qobiq epidermisining kesma qismi (uv.х 300); 3 - urug 'po'stlog'ining ko'pikli parenximasining hujayralari (uv.х 300);

4 - kotyledon parenximasi hujayralari (uv.х 300); 5 - urug'lik paltosining kesma qismi (uv.х 111); 6 - Supero'tkazuvchilar nurlar (uv.х 300); 7 - kotyledon parenximasi hujayralari (uv.х 300); 8 - kotletlonlarning kraxmalli donalari (uv.x 1200) va 9- kotletonlarning yog'li tomchilari (uv.x 1200)

Buning uchun siz xom ashyoning analitik namunasidan taxminan 20 gr og'irlikdagi namunani olib, 5 mm davomida 0,5 mm va 0,25 mm teshiklari bo'lgan elakdan o'tkazishingiz kerak. Hajmi 0,25 mm bo'lgan teshiklari bo'lgan elakdagi kukun mikropreparatlarni tayyorlash uchun ishlatiladi. Kukunning alikotasini spatula bilan stakanga soling va 2,5% NaOH eritmasini qo'shing, 2 daqiqa qaynatib oling va keyin suv bilan yuving. Keyin, ozgina miqdorda igna bilan ajratilgan bir tomchi xlorli gidrat eritmasidagi shishaga o'tkazing, qopqoq bilan yoping va mikroskop ostida tekshiring. Kraxmal donalarining mavjudligi va xususiyatlarini aniqlash uchun kukunning ozgina qismini bir tomchi suvga qo'shish kerak. Suvdagi bir nechta mikropreparatlarni ko'rishda quyidagilar ko'rinishi kerak: kraxmal donalari bilan to'ldirilgan zich yopilgan hujayralar bilan kotiledon parenximasining parchalari; tartibsiz nok shaklidagi kraxmal donalari guruhlarga va alohida-alohida va yog 'tomchilari. Xlorli gidrat eritmasida bir nechta mikropreparatlar ko'rilganda urug' terisining shimoli parenximasining qizil-jigarrang, och jigarrang qismlari ko'rinishi kerak; kotleton parenximasining kulrang-oq qismlari; Supero'tkazuvchilar nurlarning parchalari; to'g'ri devorlari bilan zich yopilgan hujayrali hujayralardan tashkil topgan qizil-jigarrang rangdagi urug 'po'stining epidermis bo'laklari. Urug'larning boshqa qismlari ham ko'rinishi mumkin (1-rasm).

Oddiy ezilgan ot kashtanini mikroskopik tahlil qilishning barcha usullari ot kashtan urug'larining anatomik tuzilishining diagnostik elementlarini ishonchli aniqlashi mumkin.

Umumiy ot kashtan urug'larining haqiqiyligini tasdiqlash TUning yangi versiyasining "Sifatli reaktsiyalar" qismida TG ni aniqlash uchun testlar o'tkaziladi. Essinning mavjudligini aniqlash uchun TLC usuli ishlab chiqilgan. Eng yaxshi natijalar mobil faza sifatida erituvchilar aralashmasi yordamida olingan: etil asetat - izopropanol - suv (40:40:30) va xromatogrammani ishlab chiqaruvchisi sifatida fosforik-volfram kislotasining 25% spirtli eritmasi. Sinov obyektlarining xromatogrammalaridagi dog'lar standart essinning namunasi bilan solishtirganda baholandi (binafsha rang taxminan 0.71).

Shakl 2. Essinning dominant tarkibiy qismlari

Oddiy ot kashtanining GH miqdorini miqdoriy baholash uchun UASni tahlil qilishning zamonaviy talablarini inobatga olgan holda xom ashyo tarkibida TG miqdorini aniqlash usulini ishlab chiqish, biz o'zboshimchalik bilan "essin" deb ataydigan to'rtta asosiy glikozidlar (1a va lb, izotsin 1a va lb) miqdorini aniqlash usuli ishlab chiqilgan. (2-rasm).

Usul quyidagi xromatografik sharoitlarga asoslanadi: to'lqin uzunligi - 210 nm (3-rasm), statsionar faza - C₁₈, ustunli suv simmetriya Cl8 250x4.6 mm, AQSh.Tarkibiy tizimni ajratish va barqarorlik jihatidan eng yaxshi bo'lgan: A komponenti: bufer eritma pH = 2,5 bo'lgan o - fosforik kislota; B komponenti: gradient elution sharoitida asetonitril. Gradient chiziqli shakli:

Время, мин	А, %	В,%
0	95	5
30	40	60
32	5	95
40	5	95

TG ning eng yaxshi ajralishi 35 ° C kolonli termostatda, ko'chma faza tezligi 1 ml / min tezlikda kuzatildi. AOK qilingan namunaning hajmi 10 mkl.

Shakl 3. Essin standart namunadagi spirtli eritmaning uv yutish spektri.

Shakl 4. Essin standart namunasining HPLC xromatogrammasi: 1, 2, 3, 4 - 1a essin, essin lb, izoessin 1a, izoessin 1b.

Essin standart namunasini xromatografik ajratishi 4-rasmda keltirilgan.

Namuna tayyorlash shartlari. Ekstraktsiyadagi essinning maksimal darajasi urug'larni olishda, zarrachalar kattaligiga qadar maydalangan, diametri 0,5 mm teshiklari bo'lgan elakdan o'tib, qaynoq suv hammomida 30 daqiqa davomida reflyuks ostida ultratovush bilan davolashdan keyin nisbati kuzatilgan 1: 100 ekstraktorga xom ashyo. Ot kashtan urug'ini ekstraktsiyalashning odatdagi HPLC xromatogrammasi shakl. 5.

Shakl 5. Oddiy ot kashtan ekstraktsiyasining HPLC xromatogrammasi: 1, 2, 3,4 - essin 1a, essin lb, izoessin 1a, izoessin lb.

TG (X,%) tarkibi mutlaq kalibrlash usuli yoki quyidagi formula bilan aniqlanadi:

C - essin standart namunasining kontsentratsiyasi, mg / ml; S₁ - bu eskin standartiga mos keladigan cho'qqining umumiy maydoni, mm²; S₂ - sinov namunasining ekiniga to'g'ri keladigan umumiy cho'qqining maydoni, mm²; V - sinov namunasining hajmi, ml; m - xom ashyo namunasining massasi, mg.

Oddiy ot kashtan urug'laridagi TG tarkibidagi suvsiz modda nuqtai nazaridan kamida 4% bo'lishi kerak.

Essinning HPLC miqdorini tekshirish

Xususiyatning asosiy mezoni ajratish darajasi - R_s, bu xromatografik tizimning yaroqliligi asosida aniqlanadi.

Xromatografik tizimning yaroqliligini sinash uchun eskin standart namunasining eritmasi ishlatilgan. Xromatografik tizim parametrlarini hisoblash ot kashtanining urug'lardan olinishini tahlil qilish sharoitida olingan 5 ta xromatogramma bo'yicha essin cho'qqilari uchun o'tkazildi. Natijalar 1-jadvalda keltirilgan.

Usulning aniqligi (takrorlanishi) 10 ta mustaqil nusxada bitta xom ashyo namunasi misolida bir qator o'lchovlar uchun S (0.1976) yoki nisbiy standart og'ish RS (4.29%) bilan tavsiflandi.

1-jadval

Gradient elutatsiya sharoitida essinning asosiy tarkibiy qismlarini ajratish parametrlari

Essin tarkibini aniqlash metodologiyasining metrologik xususiyatlari 2-jadvalda keltirilgan.

2-jadval

Oddiy ot kashtan urug'laridagi essinni miqdoriy aniqlash usulining metrologik xususiyatlari

95% ehtimollik bilan essinni aniqlash usulini aniqlashning nisbiyligi ± 3,76%.

3-jadval

Ot kashtan urug'ida saponinlarni parchalanish parametrlari, ko'chma fazaning tezligi 1 ml / min, o'lik hajmi = 2,1ga teng

Shakl 6. Essin standart namunasining kalibrlash grafigi.

Olingan natijalarga asoslanib, texnikaning analitik mintaqasi sifatida aniqlanishi mumkin bo'lgan xromatografik cho'qqilarning maydonlarining qiymatlari va ishchi intervaldagi essin tarkibi o'rtasida chiziqli bog'liqlik kuzatilganligini ta'kidlash mumkin.

Metodologiyaning aniqligi (to'g'riligi) ushbu usulning tizimli xatolarini ko'rsatadi. Jarayonda tizimli xato yo'qligini tekshirish uchun qazib olish boshlanishidan oldin to'g'ridan-to'g'ri xom ashyoga eskin qo'shilishi bilan tajribalar o'tkazildi (4-jadval).

4-jadval

Xom ashyo namunasida eskin qo'shimchalari bilan o'tkazilgan tajribalar natijalari

Usulni qo'llash doirasi 80% dan 120% gacha bo'lgan xom ashyoni miqdoriy aniqlash uchun mo'ljallangan.

Tekshiruv natijalariga ko'ra, yuqorida keltirilgan usul oddiy ot kashtanining essin tarkibini aniqlash uchun o'ziga xosligi, to'g'ri aniqlik va ko'payish qobiliyati, chiziqli bog'liqlik bilan tavsiflanadi, bu esa ot kashtan urug'lari sifatini ishonchli baholash uchun ishlatishga imkon beradi.

Ot kashtan urug'lari uchun normativ hujjatlarni ishlab chiqish

Quritilgan xom ot kashtanining 5 ta eksperimental partiyasini tahlil qilish natijasida uning miqdoriy ko'rsatkichlari normalari aniqlandi: essinning tarkibi 4% dan kam emas; namlik 12% dan oshmaydi; kulning umumiy miqdori 2,5% dan oshmasligi kerak; kul tarkibidagi xlorid kislotaning 10% eritmasida erimaydigan, 2% dan ko'p bo'lmagan; o'simlikning boshqa qismlarining tarkibi (perikarp, peduncle, novdalar, barglar), shu jumladan tahlil paytida ajratilgan qismlar 0,5% dan oshmasligi kerak; Diametri 1 mm dan oshmaydigan teshiklari bo'lgan elakdan o'tuvchi zarralar, 3% dan ko'p bo'lmagan organik aralashmalar va 0,5% dan ko'p bo'lmagan mineral aralashmalar, mikrobiologik (OFS 42-0016-04 bo'yicha) va radioaktiv (OFS 41-001 bo'yicha -03) tozalik.

Tadqiqotlar asosida TU 9377-075-04868244-2008 "Oddiy kashtan urug'lari" texnik tavsifining yangi versiyasi VILAR tomonidan ro'yxatga olingan va tasdiqlangan.

Xom ashyoning yaroqlilik muddati - 3 yil.