I. Обзор литературы

2.4. Методы исследования
2.4.1. Определение функциональной активности
симпатико-адреналовой системы


Функциональную активность САС изучали по уровню КА. Исследование КА в суточной моче является одним из адекватных методов оценки то­нуса и реактивности САС (Васильев В.И., Чугунов B.C., 1985) [31].
Перед сбором мочи для исследования КА и ДОФА из ра­цио­на питания исключались продукты, оказывающее некоторое влияние на величину катехолами­нурии: крепкий чай, кофе, алкоголь, напитки, энергетические жидкости, продукты, содержащие корицу, имбирь, гвоздику и т.д.[96]. Забор мочи для анализа производили на 2 сутки посту­пления боль­ных в стационар и через 16 и 24 недель после проведения выбранного нами лечения.
Определение КА (адреналина, норадреналина, дофамина и ДОФА) в суточной моче производили триоксииндоловым флуориметрическим методом в модификации Э.Ш. Матлиной, З.М. Киселё­вой, И.Э. Софиевой (1965) [96] в лаборатории кафедры факультетской терапии (зав. кафедрой - д.м.н., проф. Хужамбердиев М.А.) Андижанского медицинского института (ректор - д.м.н., проф. Шадманов А.К.).
Принцип метода заключается в окислении гидроксильных групп фенольного ядра КА до хинонов с последующим замыканием индольного кольца и образованием адренохром или норадренохром, которые в присутствии ще­лочи путем внутримолекулярного восстановления превращаются в аминоглютины, флуоресцирующие под влиянием ультрафиолетовых лучей.
КА и ДОФА сорбировали из мочи путем колоночной хроматографии на окиси алюминия и элюировали 0,25% раствором уксусной кислоты, которая полностью десорбировала А, НА, ДА и частично ДОФА; последний дополнительно элюировали 1N раствором соляной кислоты. Дифференцирование КА осуществ­ляли путем окисления феррицианидом калия при различных значениях рН и по различным наборам светофильторов при флуориметрии. Дофамин окисляли иодом.
Определение содержания коньюгатов КА в суточной моче производили по методу Т.И. Лукичевой, В.В. Меньшикова, Т.Д. Больша­ковой (1971) [86].
Известно, что оставшаяся часть КА, несорбированная на окиси алюминия, экскретируется с мочой в коньюгированной форме. Они легко гидролизу­ются при нагревании с кислотами (серная кислота). Гидролизовали элюат с окиси алюминия после адсорбции на ней свободных КА, добавляя к нему 0,3 мл 10 % раствора ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота). Прибавляли 0,1 мл 10N раствора серной кислоты и дово­дили рН. Затем проводили гидролиз в кипящей водяной бане в тече­нии 30 минут. Гидролизат охлаждали, добавляли 0,2 мл ЭДТА. Дальней­шую обра­ботку проб проводили также, как при определении свободных КА в этой же порции мочи.
Для определения активности фермента дезаминирования КА – моноаминоксидазы (МАО) в сыворотке крови использовали метод окислительного дезаминирования синтетического амина -бензиламина в инкубационной среде под действием МАО до бензальдегида (Горкин В.З., 1982) [43]. Исследование проводили также лаборатории кафедры факультетской терапии Андижанского медицинского института.
Принцип метода заключается в образовании из бензиламина в инкубаци­онных пробах под действием моноаминоксидазы бензальдегида, кото­рый реаги­рует в безбелковой кислой среде с избытком 2,4-динитрофенилгид­разина, обра­зуя гидрофобный гидразон (Балаклевский А.И., 1976). После цен­трифугирова­ния осадок гидразона в щелочной среде экстрагируют полярным органическим растворителем (ацетоном или этанолом), с образованием хро­мофор малиново-фиолетового цвета. Интенсивность окраски хромофора, кото­рая является мерой активности МАО, измеряли на фотоэлектроколориметре (ФЭК) (γ=540). Активность аминоксидазы рассчитывали по формуле:
А=(Ео-Ек)х2х1/3
где 2-коэффициент пересчета на 1 час инкубации проб в течении 3 часов.
Ак­тивность фермента выражали в единицах экстиненции на 1 мл сыворотки крови за 1 час инкубации.