|
1.2.
Yangi alfa/beta gidrolaza domen oqsilining K. marxianusning
lignoselülozik biomassadan olingan ingibitorlarga chidamliligiga
ta'siri.
Mikroorganizmning ko'p inhibitorlarga chidamliligi bioyoqilg'i va boshqa kimyoviy
moddalar uchun istiqbolli qayta tiklanadigan va barqaror manba bo'lgan
lignoselülozik biomassaning biokonversiyasida muhim ahamiyatga ega. Ushbu
tadqiqotda KmYME deb nomlangan va mitoxondriyada joylashgan noma'lum a/b
gidrolazaning buzilishi xamirturushning lignoselülozadan olingan inhibitorlarga,
xususan, sirka kislotasi, furfural va 5-HMFga nisbatan sezgir bo'lishiga olib keldi.
KmYME buzilgan shtamm ko'proq mitoxondriyal membrana potentsialini yo'qotdi,
plazma membranasining o'tkazuvchanligini, qattiq redoks nisbati nomutanosibligini
va ROS to'planishini ko'rsatdi, xuddi shu inhibitorlar ishtirokida buzilmagan shtamm
bilan solishtirganda. KmYME buzilgan shtammdagi ATP, NAD va NADP ning
hujayra ichidagi kontsentratsiyasi kamaydi. Biroq, KmYME ning buzilishi
transkripsiya darajasida gen ifodasining sezilarli o'zgarishiga olib kelmadi. KmYME
inhibitorlarga qarshilik ko'rsatish uchun zarur bo'lgan esteraza/tioesteraza faolligiga
ega edi. Bundan tashqari, etanol, harorat va osmotik bosim kabi boshqa stresslarga
qarshilik ko'rsatish uchun KmYME ham talab qilingan. S. cerevisiae da ikki mumkin
boʻlgan gomologik genlarning buzilishi ham uning ingibitorlarga chidamliligini
pasaytirdi.
2-rasm
Grafik abstrakt. K. marxianusdagi KmYME ingibitorlariga mumkin bo'lgan
bardoshlik mexanizmlari.
13
Lignoselülozik biomassa arzonligi, keng miqyosda mavjudligi va oziq-ovqat
ishlab chiqarish bilan raqobatlashmasligi tufayli qayta tiklanadigan bioyoqilg'i va
boshqa kimyoviy moddalar uchun istiqbolli manba hisoblanadi (Kamm va Kamm,
2004; Yinbo va boshq., 2006; Somerville va boshqalar. , 2010). Biroq,
lignoselülozik biomassani oldindan tozalash jarayonida ingibitorlar shakar va lignin
degradatsiyasining yon mahsuloti, shu jumladan zaif kislotalar, furan hosilalari va
fenolik birikmalar sifatida hosil bo'ladi. Ushbu birikmalar mikrob hujayralari
metabolizmi va fermentatsiyasini inhibe qiluvchi turli xil toksik mexanizmlar va
sinergik ta'sirga ega (Palmqvist va Hahn-Hägerdal, 2000; Almeida va boshq., 2007).
Demak, ushbu inhibitorlarga chidamlilik mexanizmini aniqlash sanoat
fermentatsiyasi uchun mustahkam shtammni qurishda muhim ahamiyatga ega.
Kluyveromyces marxianus "umuman xavfsiz deb hisoblanadigan" (GRAS)
mikroorganizm bo'lib, u termobardoshliligi, yuqori o'sish tezligi va keng substrat
spektri tufayli lignoselülozik biomassaning bioetanol fermentatsiyasida tobora
ko'proq e'tiborni tortdi (Zhang va boshq., 2015). K. marxianus shtammlari 40°C
haroratda 0,86–0,99 soat–1 oʻsish tezligi bilan oʻsishi mumkin, baʼzi shtammlar esa
52°C gacha boʻlgan haroratda ham oʻsadi (Banat va Marchant, 1995). Ko'tarilgan
harorat lignotsellyulozani shakarlashda ishlatiladigan tsellyulolitik fermentlar uchun
mos keladi (optimal harorat 45-50 ° C) va bir vaqtning o'zida shakarlanish va
fermentatsiya (SSF), shuningdek, bir vaqtning o'zida shakarlash va kofermentatsiya
(SSCF) uchun afzalliklarni beradi (Chjan va boshq. , 2016; Kong va boshqalar,
2019). Bundan tashqari, yuqori haroratda sanoat fermentatsiyasi sovutish narxini va
ifloslanish xavfini kamaytiradi (Banat va Marchant, 1995). Ksiloza glyukozadan
tashqari lignoselülozik biomassaning asosiy gidroliz mahsulotlaridan biridir va K.
marxianus tabiiy ravishda ksilozadan foydalanishi mumkin (Wilkins va boshq.,
2008). Biroq, K. marxianusning bir nechta inhibitorlarga tolerantligi juda kuchli
emas va K. marxianusning bir nechta inhibitorlarga tolerantligi haqidagi bilim
oldingi tadqiqotlarda kam edi (Oliva va boshq., 2003; Oliva va boshq., 2004).
Oldingi tadqiqotimizda, K. marxianusning xarakterlanmagan a/b-gidrolaz
domenini (ABHD) o'z ichiga olgan gen (GenBank BAP69980, joylashuv yorlig'i
14
KMAR_10772) ifodasi lignoselülozik bilan oldindan ishlov berishdan olingan
inhibitorlar ishtirokida sezilarli darajada yuqori tartibga solingan. biomassa (Vang
va boshq., 2018). Bu erda biz uning ingibitorlarga tolerantlikka ta'siriga, oqsil
xususiyatiga va uning inhibitorlariga bardoshlik mexanizmiga e'tibor qaratdik. Biz
ushbu genning buzilishi K. marxianusdagi inhibitorlarga nisbatan tolerantlikni
kamaytirishini aniqladik. Ushbu noma'lum protein mitoxondriya matritsasida
joylashganligi va inhibitorlarga qarshilik ko'rsatish uchun zarur bo'lgan in vitro
esteraza/tioesteraza faolligiga ega ekanligi aniqlandi. Biz ushbu genning buzilishi
ingibitorlar ishtirokida ATP va NAD(P)H sinteziga xalaqit beradigan hujayra
ichidagi CoASH hovuzini buzish orqali inhibitorlarga nisbatan bardoshlikni
pasaytiradi, degan xulosaga keldik. Bundan tashqari, KmYME osmik bosim (shakar
va tuz), etanol va haroratni o'z ichiga olgan boshqa stresslarga qarshilikning keng
spektrini ko'rsatdi. Saccharomyces cerevisiae tarkibidagi gomologik oqsil ham bir
nechta inhibitorlarga qarshilik ko'rsatdi. Ushbu tadqiqot bir nechta inhibitorlarning
qarshilik mexanizmini yaxshiroq tushunish uchun foydali ma'lumotlarni taqdim
etishi mumkin, bu esa tsellyuloza biomassasini substrat sifatida ishlatishi mumkin
bo'lgan sanoat fermentatsiyasi uchun mustahkam shtammni yaratishda muhim
ahamiyatga ega.
Xamirturush ekstrakti/pepton dekstrozi (YPD) 10 g/l xamirturush ekstrakti,
20 g/l pepton, 20 g/l glyukoza o'z ichiga olgan achitqilarni etishtirish uchun
ishlatilgan. Aminokislotalarsiz 6,7 g/L achitqi azot asosini o'z ichiga olgan sintetik
tomchi (SD) muhiti, tegishli qo'shimchalar bilan to'ldirilgan 20 g / l glyukoza
xamirturush transformantlarini tekshirish uchun ishlatilgan. 100 mkg/ml
ampitsillinli Luria-Bertani (LB) muhiti gen klonlash uchun Escherichia coli Top10
va oqsilni ifodalash uchun BL21 (DE3) ni etishtirish uchun ishlatilgan. K. marxianus
NBRC1777 NITE Biologik Resurs Markazidan (Tokio, Yaponiya) olingan. K.
marxianus YHJ010 NBRC1777 ning TRP1, LEU2, URA3 auksotrofik shtammidir
(Hong va boshq., 2007). S. cerevisiae W303 1A ADE2, TRP1, LEU2, URA3 va
HIS3 oksotrofik shtammidir (ATCC 208352).
15
Ushbu tadqiqotda foydalanilgan barcha plazmidlar 1-jadvalda keltirilgan.
Plazmid konstruktsiyasi 1-qo'shimcha faylda batafsil tavsiflangan. Primer juftlari
qo'shimcha fayl 1da keltirilgan: qo'shimcha jadval S1.
Do'stlaringiz bilan baham: |
