|
23
24
Xulosa.
PDB ma'lumotlar bazasida va ESTHER ma'lumotlar bazasida a/b-hidrolaza
qatlamli
oqsillar
oilasi
uchun
ketma-ketlik
homologiyasi
qidiruvi
(http://bioweb.ensam.inra.fr/ESTHER/general?what=index) (Hotelier va boshq.,
2004) mos ravishda PSI- va PHI-BLAST va BLASTP dasturlari yordamida amalga
oshirildi. EstA strukturasi AMoRe (Navaza, 1994) bilan molekulyar almashtirish
usuli bilan, qidiruv modeli sifatida, kristalli G. kandidum lipazaning N-terminal
qoldiqlari 1-395 (qo'shilish kodi) ni ulash orqali ishlab chiqilgan kimera
shablonidagi koordinatalardan foydalangan holda hal qilindi. : 1THG [Schrag va
Cygler, 1993]) kristalli sichqonchani asetilkolinesterazasining (AChE) C-terminal
qoldiqlari 384-543 (kirish kodi: 1MAA [Bourne va boshq., 1999]). Ushbu
protsedura 15-4 Å o'lchamlari oralig'ida 19% korrelyatsiya koeffitsientini va 49,7%
R omil qiymatini berdi. 1028 ta qoldiqdan 1005 tasi (polipeptid zanjirining 98%)
hech qanday qo'l aralashuvisiz qurilgan va ARP/wARP yordamida mos ravishda
20,3% va 28,5% R faktor va Rfrsiz qiymatlarigacha tozalangan (Perrakis va boshq.,
1999). ARP/wARP modelining yakuniy takomillashtirish bosqichlari REFMAC
(Murshudov va boshq., 1997) yordamida 30 va 2,1 Å oralig'idagi ma'lumotlardan
foydalangan holda amalga oshirildi; natijada olingan SigmaA vaznli 2Fo-Fc va Fo-
Fc elektron zichligi xaritalari dastlabki ketma-ketlikdagi xatolarni aniqlash va
TURBO-FRODO grafik dasturi yordamida modelni tuzatish uchun ishlatilgan
(Roussel va Cambillau, 1989).
Yakuniy EstA tuzilmasi assimetrik birlikdagi 2 molekulaning har biri uchun
Ser22/Gln26 dan Val538 qoldiqlarini, 2 ta toʻliq boʻlmagan ikki antennali N-
bogʻlangan glikan zanjirlarini, GlcNAc2Man3GlcNAc2, 2 GlcNAc2 disaxaridlarini,
NA15 molekulalarini va molekulyar molekulalarni oʻz ichiga oladi. , va 2 sulfat va
1 xlorid ionlari. Asimmetrik birlikdagi ikkita molekula orasidagi o'rtacha ildiz-
o'rtacha kvadrat og'ish 513 Ca atomi uchun 0,15 Å ni tashkil qiladi. Strukturaning
stereokimyosi PROCHECK bilan tahlil qilindi (Laskowski va boshq., 1993);
taxminiy katalitik Ser210 bundan mustasno, Ramachandran uchastkasining ruxsat
etilmagan hududlarida hech qanday qoldiq topilmadi.
25
Elektrostatik sirt potentsiallari GRASP (Nicholls va boshq., 1991) yordamida
100 mM tuz konsentratsiyasi, ichki va tashqi dielektrik doimiylari mos ravishda 2
va 80 va Uning qoldiqlari bo'yicha o'rtacha zaryad 0 dan foydalangan holda
hisoblangan; sichqoncha AChE (Bourne va boshq., 1999) bo'yicha qiyosiy hisob-
kitoblar bir xil parametrlardan foydalangan. Raqamlar ESPript (Gouet va boshq.,
1999), SPOCK (Kristofer, 1998) va Raster3D (Merritt va Bekon, 1997) yordamida
yaratilgan.
Asil p-nitrofenil (pNP) substratlarida (suvli eritmalarda 0,25 mM) esteraza
faolligi 25 mM sitrat tamponida, pH 4,5 yoki 25 mM fosfat tamponida, pH 6,0da
amalga oshirildi; reaktsiya to'xtatildi va pH Na2CO3 bilan 9-9,5 ga keltirildi va
ajralib chiqqan fenol spektrofotometriya (l = 405 nm) bilan miqdori aniqlandi. Suvda
erimaydigan palmitat va stearat esterlari uchun eritmalar (25 mM) asetonitrilda edi.
Lipaza faolligi va sinnamoil va feruolil esteraza faolligi Sommer va boshqalar
tomonidan ta'riflanganidek tekshirildi. (1997) va Donaghy va boshqalar. (1998),
mos ravishda. Karboksilik efir eritmalari va emulsiyalarning gidrolizi pH statistik
(TTT 80 Radiometer, Kopengagen, DM), 25 ° C da va 30 ml 2,5 mM Tris, pH 5,0,
0,1 M NaCl da va EstA konsentrasiyalari yordamida potentsiometrik tarzda
kuzatildi. 0,1-0,5 mkg ml-1 diapazoni (1-6 nM, 80 kDa massaga asoslangan). Vinil
esterlar va triatsilgliserollarning ortib borayotgan kontsentratsiyasida ferment
faolligini o'lchash uchun standart sharoitlar ishlatilgan (Chahinian va boshq., 2000).
Karboksilik efirlarning to'yingan eritmalariga nisbatan faollikni o'lchash uchun hech
qanday detarjan yoki emulsifikator qo'shilmagan. Chiqarilgan yog 'kislotalari 0,1 M
NaOH bilan titrlangan. Sirka, propion yoki butir kislotasining pH 5,0 va 25°C da
qisman dissotsiatsiyasi uchun tuzatish kiritildi (tegishli pKa qiymatlari: 4,75, 4,87
va 4,87). Katalitik doimiy (kcat) qiymatlari EstA uchun 80 kDa va cho'chqa jigari
esterazasi va Electrophorus electricus AChE (Sigma-Aldrich) uchun 60 va 80 kDa
massalardan foydalangan holda, substratning optimal konsentratsiyasida qayd
etilgan maksimal tezliklar (Vm) qiymatlaridan hisoblab chiqilgan. Michaelis
doimiysi (Km) qiymatlari kinetik ma'lumotlarning ikki tomonlama o'zaro
Lineweaver-Burk chizmalaridan grafik tarzda aniqlandi.
26
EstA
gomologlarining
bashorat
qilingan
ketma-ketligi
Uaytxed
instituti/Massachusets texnologiya instituti (MIT) Genom tadqiqotlari markazi (N.
crassa, M. grisea, A. nidulans va F. graminearum) yoki Milliy Biotexnologiya
Axborot Markazi (NCBI) eukaryotik genom ma'lumotlar bazasidan (A. fumigatus
va C. posadasi). Olingan oqsil ketma-ketligi MULTALIGN (Korpet, 1988)
yordamida tekislangan.
Biz ushbu loyiha tashabbuskori (AFMB) ga minnatdorchilik bildiramiz;
27
Do'stlaringiz bilan baham: |
