1. Protoplastlarni olish va kultura holatida o‘stirish Protoplastlarni ajratib olish. Protoplast–bu sellyulozadan tashkil topgan qobiqdan ajratilgan, sitoplazmatik membrana bilan qoplangan, o‘simlik hujayrasi uchun xos bo‘lgan barcha xossa va xususiyatlarga ega bo‘lgan hujayra hisoblanadi. Dastlab protoplastlar 1892– yilda J.Klerker tomonidan ajratib olingan va bunda mexanik usuldan foydalanilgan. Bu usulda plazmoliz holatiga keltirilgan hujayraning qobig‘i kesiladi va protoplastlar tashqi muhitga ajralib chiqadi. Hozirgi vaqtda bu usul bir qator o‘zgartirishlar asosida modifikatsiyalangan va mukammallashtirilgan, biroq bu usul bir qator cheklanishlarga ega hisoblanadi, jumladan:
Unumdorligi yuqori emasligi;
Bu usulda faqat ekstensiv plazmolizga uchrovchi to‘qimalardangina foydalanish mumkinligi;
Nisbatan qiyinligi va uzoq vaqt davomiyligiga egaligi bilan tavsiflanadi.
Protoplastlarni ajratib olishning boshqa bir usuli–bu fermentlardan foydalanishga asoslanilgan, enzimatik usul hisoblanadi. 1952–yilda Salton tomonidan lizotsim fermenti yordamida birinchi marta bakteriya hujayralari devori buzilishi amalga oshirilgan. 1960–yilda Kokking tomonidan pomidor ildizi uchki qismi mog‘or zambrug‘i (Myrothecium verrucaria) kultura suyuqligi tarkibidan ajratib olingan gidrolitik ferment bilan ishlov berilgan va birinchi marta yuksak o‘simliklarning protoplastlari enzimatik usulda ajratib olinishiga muvaffaq bo‘lingan.
Enzimatik usulning mexanik ajratib olish usuliga nisbatan solishtirilganda ustunliklari quyidagilardan tashkil topadi:
Bir vaqtning o‘zida katta miqdorda protoplastlarning ajratib olinishi mumkin (ya’ni, bir gramm to‘qimadan yoki hujayralardan 10 000 000 donagacha protoplast ajratib olinishi mumkin);
Bu usulda hujayralar kuchli osmotik stress ta’siriga uchratilmaydi;
Hujayralar jarohatlanmaydi;
Bu usulni amalga oshirish nisbatan tezkorlikka ega hisoblanadi.
Hujayra devorini olib tashlash uchun uchta tipdagi fermentlardan foydalaniladi: ya’ni, sellyulaza, gemitsellyulaza va pektinaza. Fermentlar kombinatsiyasi va ularning o‘zaro nisbatlari har bir hujayralar tiplari uchun spesifik tavsifga ega hisoblanadi.
Protoplastlarni ajratib olish quyidagi ko‘rinishdagi uchta bosqichni o‘z ichiga oladi:
Fermentlar bilan ishlov berish.
Hujayra devoridan protoplastlarni ajratib olish.
Intakt protoplastlarni hujayra qoldiqlaridan ajratib olish.
Hujayra kulturalarida genetik tadqiqotlarni amalga oshirish maqsadlarida somatik hujayralarning gibridizatsiyasi usuli hatto bundan 15 yil oldin ishlab chiqilgan. Uning asosida protoplastlarning su’niy ravishda qo‘shilishini yuzaga keltirish yo‘li bilan genetik rekombinatsiyalash uslubiyati ishlab chiqilgan; bu usuldan hozirgi vaqtda zambrug‘lar va o‘simlik materiallari ustida olib boriluvchi tadqiqot ishlarida muvafaqqiyatli ko‘rinishda foydalaniladi. Bu ko‘rinishdagi qo‘shilgan hujayra asosidagi dastlabki mahsulot har ikkala ota– ona hujayra genomlarini o‘zida mujassamlashtirgan hujayradan tashkil topadi.
Shuningdek, produsentlar seleksiyasida ularni faol holatda ushlab turish va saqlash bo‘yicha yangi usullarning amaliyotga tadbiq etilishi amalga oshirilmoqda. Masalan, achitqilar va mog‘or zambrug‘larining faol ko‘rinishdagi produsentlarini olish uchun protoplastlarning qo‘shilishi usulidan foydalaniladi, bunda hujayra devori olib tashlanganidan keyin polietilenglikolning hujayra membranasiga ta’siri amalga oshiriladi va u qisman erigan holatga o‘tkaziladi, bu holatda ikkita shtammning protoplastlarining o‘zaro qo‘shilishi amalga oshishi mumkin va navbatdagi bosqichda genetik materialning rekombinatsiyasi ro‘y beradi.
O‘simliklarda somatik hujayralarning gibridizatsiyasi yo‘nalishida dastlabki qadamlar qo‘yilgan. Protoplastlarning 0,25 M natriy nitrat eritmasida suspenziyasi sharoitida qo‘shilish juda tez amalga oshadi.
