Genetika muhandisligining eng yaxshi 4 ta vositasi

Genetika muhandisligining eng yaxshi 4 ta vositasi

Genomik kutubxonani yaratish butun genomik DNKni klonlashni o'z ichiga oladi. Demak, genomik kutubxona bu rekombinant DNK molekulalarining (plazmidlar, faglar) to'plamidir, shuning uchun ushbu to'plamdagi DNK qo'shimchalarining yig'indisi organizmning butun genomini ifodalaydi. Prokaryotik yoki eukaryotik genom hajmiga qarab vektor tanlanishi mumkin. Shunday qilib, butun genom bo'laklarga bo'linishi va vektorlarda yoki PCR texnikasi bilan klonlanishi mumkin. Buni genomik klonlash deb atash mumkin.

Genomik kutubxonani yaratish quyidagi bosqichlarni o'z ichiga oladi:

1. Xromosoma DNKsining izolyatsiyasi

2. DNKning parchalanishi mexanik kesish yoki sonikatsiya yo'li bilan yoki DNKni qisman hazm qilish uchun mos endonukleaza yordamida amalga oshiriladi (15.1-rasm). Mexanik qirqish to'mtoq uchlarini hosil qiladi, endonukleaza esa yopishqoq uchlarni hosil qiladi. To'liq hazm qilishning oldini oladi, chunki u ishlatish uchun juda heterojen bo'laklarni hosil qiladi.

3. DNK bo'laklarini bog'lash - Genomik DNKning qisman hazm bo'lishi zarur o'lchamdagi fragmentlarni ajratish uchun agaroz gel elektroforeziga duchor bo'ladi. Tegishli o'lchamdagi bo'laklar jeldan olinadi. Keyin bu bo'laklar mos vektorga kiritiladi. Bu vektorlar bir xil cheklovchi fermentlar bilan kesiladi. Shundan so'ng DNK fragmentlari DNK ligaza yordamida vektorga bog'lanadi (15.2-rasm). Ushbu texnika yordamida vektorlarga taxminan 25 kb DNK fragmentlarini kiritish mumkin.

4. Istalgan klonni identifikatsiyalash- Koloniyani duragaylashda mos duragaylash probini qo'llash orqali kerakli DNK fragmentini o'z ichiga olgan bakterial koloniyani aniqlash. Zond genning mRNKsi, uning mRNKsining cDNKsi, boshqa organizmning homolog geni yoki kerakli gen/DNK fragmentining bir qismi ketma-ketligini ifodalovchi sintetik oligonukleotid bo'lishi mumkin. Gibridlanishni aniqlash uchun prob odatda radio etiketli izotop bilan etiketlanishi kerak.





Genomik kutubxonani yaratish uchun muqobil vektor tizimlari:

Plazmidlarda gen kutubxonalarini yaratishga yaroqli prokaryotlar (kichik genomlar) uchun. Plazmid qo'shimchalari odatda -5-10 kb, shuning uchun vakillik kutubxonasi uchun faqat bir necha ming rekombinant kerak. Eukaryotlar (kattaroq genomlar) juda kattaroq DNK bo'laklarini ushlab turadigan vektorlarga muhtoj (15.1-jadval).



Lambda bakteriofaglari E. coli infektsiyasini plazmid transformatsiyasiga qaraganda ancha samaraliroq ko'rsatadi. Fag lambda E. coli yuzasidagi retseptorlari bilan bog'lanadi va DNKni in'ektsiya qiladi. Lambda tomonidan infektsiya plazmid transformatsiyasi – olishi mumkin bo'lganidan ancha samaralidir

1 mikrogram DNKga 10 9 ta blyashka

MA `LUMOT

7.12: Genetika Injeneriyasi Vositalari - Biologiya

7.12: Genetika muhandisligi vositalari

Genetika muhandisligining eng yaxshi 4 ta vositasi

Genomik kutubxonani yaratish butun genomik DNKni klonlashni o'z ichiga oladi. Demak, genomik kutubxona bu rekombinant DNK molekulalarining (plazmidlar, faglar) to'plamidir, shuning uchun ushbu to'plamdagi DNK qo'shimchalarining yig'indisi organizmning butun genomini ifodalaydi. Prokaryotik yoki eukaryotik genom hajmiga qarab vektor tanlanishi mumkin. Shunday qilib, butun genom bo'laklarga bo'linishi va vektorlarda yoki PCR texnikasi bilan klonlanishi mumkin. Buni genomik klonlash deb atash mumkin.

Genomik kutubxonani yaratish quyidagi bosqichlarni o'z ichiga oladi:

1. Xromosoma DNKsining izolyatsiyasi

2. DNKning parchalanishi mexanik kesish yoki sonikatsiya yo'li bilan yoki DNKni qisman hazm qilish uchun mos endonukleaza yordamida amalga oshiriladi (15.1-rasm). Mexanik qirqish to'mtoq uchlarini hosil qiladi, endonukleaza esa yopishqoq uchlarni hosil qiladi. To'liq hazm qilishning oldini oladi, chunki u ishlatish uchun juda heterojen bo'laklarni hosil qiladi.

3. DNK bo'laklarini bog'lash - Genomik DNKning qisman hazm bo'lishi zarur o'lchamdagi fragmentlarni ajratish uchun agaroz gel elektroforeziga duchor bo'ladi. Tegishli o'lchamdagi bo'laklar jeldan olinadi. Keyin bu bo'laklar mos vektorga kiritiladi. Bu vektorlar bir xil cheklovchi fermentlar bilan kesiladi. Shundan so'ng DNK fragmentlari DNK ligaza yordamida vektorga bog'lanadi (15.2-rasm). Ushbu texnika yordamida vektorlarga taxminan 25 kb DNK fragmentlarini kiritish mumkin.

4. Istalgan klonni identifikatsiyalash- Koloniyani duragaylashda mos duragaylash probini qo'llash orqali kerakli DNK fragmentini o'z ichiga olgan bakterial koloniyani aniqlash. Zond genning mRNKsi, uning mRNKsining cDNKsi, boshqa organizmning homolog geni yoki kerakli gen/DNK fragmentining bir qismi ketma-ketligini ifodalovchi sintetik oligonukleotid bo'lishi mumkin. Gibridlanishni aniqlash uchun prob odatda radio etiketli izotop bilan etiketlanishi kerak.





Genomik kutubxonani yaratish uchun muqobil vektor tizimlari:

Plazmidlarda gen kutubxonalarini yaratishga yaroqli prokaryotlar (kichik genomlar) uchun. Plazmid qo'shimchalari odatda -5-10 kb, shuning uchun vakillik kutubxonasi uchun faqat bir necha ming rekombinant kerak. Eukaryotlar (kattaroq genomlar) juda kattaroq DNK bo'laklarini ushlab turadigan vektorlarga muhtoj (15.1-jadval).



Lambda bakteriofaglari E. coli infektsiyasini plazmid transformatsiyasiga qaraganda ancha samaraliroq ko'rsatadi. Fag lambda E. coli yuzasidagi retseptorlari bilan bog'lanadi va DNKni in'ektsiya qiladi. Lambda tomonidan infektsiya plazmid transformatsiyasi – olishi mumkin bo'lganidan ancha samaralidir

1 mikrogram DNKga 10 9 ta blyashka

Plazmid DNKning mikrogramiga 10 6 koloniya.

Bakterial hujayralar parchalanishi natijasida blyashka hosil bo'ladi, bu esa ko'proq hujayralar infektsiyalangan va lizis bo'lganda tarqaladi. Blyashka yuqumli virusli zarralar yoki virionlarni o'z ichiga oladi va ularning har biri alohida lambda klonini ifodalaydi (alohida plazmid klonini ifodalovchi bakterial koloniyaga o'xshash).

Tashqi ko'rinishi ‘bulut’ bakterial hujayralar (bakterial ‘lawn’)da aniq doira shaklida (15.3-rasm). Agar uzoq vaqt davomida inkubatsiya qilinsa, bu doiralar o'sishda davom etadi (ko'proq va ko'proq virusli zarralarni o'z ichiga oladi) va barcha bakterial hujayralar yo'q qilinmaguncha tarqaladi. Bitta lambda klonini tanlash uchun blyashka agar plastinadan ‘teshiladi’ va ushlab turuvchi eritmada saqlanadi. Keyinchalik bu ko'proq bakterial hujayralarni yuqtirish va rekombinant lambda DNKsini ko'paytirish uchun ishlatilishi mumkin.



Kattaroq qo'shimchalar bilan kutubxonalar yaratish uchun vektorlar:

Kosmid kutubxonalari katta intronli genlarni klonlash va genomning katta qismlarini ketma-ketlashtirish uchun ishlatiladi. Kosmid vektorlar plazmid va bakteriofag lambda l DNK gibridlaridir (kichik

5 YAC kutubxonalari juda katta DNK fragmentlarini (1 Mb dan ortiq) klonlash uchun ishlatiladi va katta genlarni (masalan, 250 kb kistik fibroz geni) klonlash va alohida ajratilgan xromosomalar kabi bir-birining ustiga tushadigan katta klonlar kutubxonalarini yaratish uchun foydalidir. organizmlardan (xromosoma kutubxonalari). Ular murakkab organizmlarning (masalan, Homo sapiens) genomlarini xaritalash uchun keng qo'llanilgan.

YAC'lar xamirturushli sun'iy xromosomalar bo'lib, bakterial plazmid DNK va xamirturush DNKsining gibridlaridir. Tabiiy xamirturush xromosomalarining replikatsiyasi/segregatsiyasi uchun zarur bo'lgan komponentlar E. coli plazmid DNKsi bilan birlashtirilgan. YAClar Saccharomomyces cerevesiae xamirturushida o'stiriladi va shuning uchun xost tizimi uchun mos bo'lgan tanlab olinadigan markerlarni o'z ichiga oladi. Antibiotiklarni tanlash o'rniga, xamirturush tanlanadigan markerlar o'ziga xos ozuqa moddalari bo'lmagan selektiv muhitda transformatorning o'sishini ta'minlaydi. (Transformantlar o'sishga qodir emas). Amaldagi xamirturush shtammlari auksotrofik –, ya'ni ular ma'lum bir birikma hosil qila olmaydi.

Misol uchun, Trpl mutantlari triptofan hosil qila olmaydi, shuning uchun faqat triptofan bilan to'ldirilgan muhitda o'sishi mumkin. Agar mutant shtammi o'z ichiga buzilmagan Trpl genini o'z ichiga olgan YAC bilan o'zgartirilsa, u holda bu faol bo'lmagan gen (komplement) ni qoplaydi va transfektsiyalangan hujayra triptofan yetishmaydigan muhitda o'sishga qodir.

O'ziga xos muammolar tufayli YAClar endi keng qo'llanilmaydi. Masalan, YAC klonlari genomning qo'shni bo'lmagan segmentlarini o'z ichiga olishi mumkin. Bu shuni anglatadiki, genomning alohida qismlaridan 2 yoki undan ortiq DNK fragmentlari individual YACga birlashtirilishi mumkin (chunki ular juda katta qo'shimchalarni qo'llab-quvvatlashga qodir). Ikkinchi muammo shundaki, YAClar beqaror va tarqalish paytida ko'pincha DNK qismlarini yo'qotadi.

BAC kutubxonalari juda katta DNK fragmentlarini klonlash uchun ham ishlatiladi va ayniqsa katta genomlarni ketma-ketlashtirish uchun foydali bo'lgan. BAC bakterial sun'iy xromosomalar bo'lib, ular tabiiy ravishda paydo bo'lgan katta bakterial plazmid F omilga asoslangan. BAC vektorlari 300 kb gacha bo'lgan DNK qo'shimchalarini sig'dira oladi, bu katta genlarni klonlash yoki murakkab genomlarni xaritalash va ketma-ketlashtirish kerak bo'lganda ham juda hurmatga sazovor. BAClar YAClarga nisbatan bir qator afzalliklarga ega, ya'ni ular hozirda kengroq qo'llaniladi. Inson genomining aksariyati YAC klonlari emas, balki BAC yordamida ketma-ketlashtirilgan.

Asbob № 2. cDNK va cDNA Lkutubxona:

Komplementar DNK (cDNK) - bu teskari transkriptaza deb ataladigan maxsus ferment yordamida mRNKdan tayyorlangan sintetik DNK (RNKga bog'liq DNK polimeraza 1970 yilda Temin va Baltimor tomonidan kashf etilgan). Dastlab bu ferment retroviruslardan ajratilgan. Bu ferment DNK polimeraza kabi reaksiyalarni amalga oshiradi va erkin 3′ OH terminali bo'lgan primerni talab qiladi. Shablon sifatida mRNKdan foydalangan holda, teskari transkriptaza bir zanjirli DNK molekulasini sintez qiladi, keyinchalik uni ikki zanjirli DNK uchun shablon sifatida ishlatish mumkin (15.4-rasm). mRNK dan yaratilganligi sababli, cDNK yuqori va quyi oqimdagi tartibga soluvchi ketma-ketliklardan va intronlardan mahrum.

Bu shuni anglatadiki, eukaryotlardan cDNK bakteriyalarda funktsional oqsilga aylanishi mumkin, bu bakterial xostda eukaryotik genlarni ifodalashda muhim xususiyatdir. Qisqa oligo (dT) zanjiri mRNK zanjirining poli (A) dumiga gibridlanadi. Oligo (dT) segmenti mRNKni cDNK zanjirini sintez qilish uchun shablon sifatida ishlatadigan teskari transkriptaza ta'siri uchun primer bo'lib xizmat qiladi. Olingan cDNK soch tolasi bilan tugaydi. RNK-DNK gibrididan olingan mRNK NaOH yoki RNase H bilan ishlov berish natijasida parchalanganda, RNKning qisqa qismi qoladi. Ushbu soch pinli halqa DNK polimeraza I uchun primer bo'lib, u juftlangan DNK zanjirini to'ldiradi.

Keyin halqa SI nukleazasi (faqat bitta zanjirli halqaga ta'sir qiladi) tomonidan yorilib, ikki zanjirli cDNK molekulasini hosil qiladi. Ushbu ikki zanjirli DNK plazmid, kosmid, fag lambda, klonlash vektorlariga to'mtoq uchli bog'lash orqali kiritilishi mumkin.



cDNK kutubxonasi - bu organizm yoki to'qimadan ajratilgan har bir mRNK plazmid yoki fag vektoriga uning cDNK qo'shilishi sifatida ifodalangan bakterial transforantlar yoki fag lizatlarining populyatsiyasi. Bunday kutubxonadagi o'ziga xos cDNK chastotasi ushbu to'qimadagi tegishli mRNK chastotasiga bog'liq bo'ladi.

Asbob № 3. Genlar va gen transkriptlarini tahlil qilish:

Rekombinant DNK texnologiyasi qiziqish genining lokalizatsiyasini o'z ichiga oladi. Ushbu gen ajratilishi yoki sintez qilinishi mumkin, ular transgen o'simliklar va hayvonlarni ishlab chiqarishga olib keladigan transformatsiya uchun manipulyatsiya qilishdan oldin ishlatiladi. Ribosomal RNK geni, noma'lum gen mahsuloti bilan fenotipik belgilar uchun gen, o'ziga xos protein mahsulotlari va tartibga solish funktsiyalarida ishtirok etadigan genlar kabi genlarning turli navlarini izolyatsiya qilish uchun turli xil usullar qo'llanilgan. promotor genlar va boshqalar.

Ribosomal RNK genlarini izolyatsiya qilish:

Ribosomal RNK umumiy RNKning 80% ni tashkil qiladi va ajratilishi mumkin bo'lgan ribosoma genida sintezlanadi. Bu genni ajratib olish rRNKning ba'zi xususiyatlari tufayli oson bo'ldi (a) ribomsomal genlar bir necha nusxada mavjud (b) ribosoma genlari va boshqa genlar o'rtasidagi farq, ularning rRNKdagi nisbatan yuqori G + C tarkibi tufayli. Ribosomal gen birinchi marta 1965 yilda H. Wallace va M.L. Ksenopus ismli amfibiyadagi Birnstiel.

rRNK genlarini izolyatsiya qilishning turli bosqichlari quyidagilardan iborat:

1. rRNK ribosomalardan ajratiladi va ular tritiatsiyalangan uridinli muhitda replikatsiya qilish imkonini berish orqali radiobelgilanadi.

2. Ribosomal DNK zichlik gradienti sentrifugalash (rDNKning yuqori G+C tarkibi uni DNKning qolgan qismidan sentrifugalash orqali ajratishni osonlashtiradi), so‘ngra uning denaturatsiyasi bilan ajratiladi.

3. So‘ngra bir zanjirli DNK filtr qog‘oziga mahkamlanadi va qog‘ozga etiketlangan RNK qo‘shiladi.

4. Endi DNK va RNK gibridlanishi sodir bo'ladi va ortiqcha etiketli RNK yuviladi.

5. Radioaktivlik o'lchanadi va dupleks gibrid bo'lib, u denaturatsiya natijasida ikki zanjirli bo'lishi mumkin bo'lgan bir zanjirli DNK beradi. rRNK genini shu tarzda ajratib olish mumkin.

4. Endi DNK va RNK gibridlanishi sodir bo'ladi va ortiqcha etiketli RNK yuviladi.

5. Radioaktivlik o'lchanadi va dupleks gibrid bo'lib, u denaturatsiya natijasida ikki zanjirli bo'lishi mumkin bo'lgan bir zanjirli DNK beradi. rRNK genini shu tarzda ajratib olish mumkin.

Maxsus oqsillar genini izolyatsiya qilish:

Bu teskari transkriptaza fermenti yordamida mumkin. Bu ferment RNK dan nusxa/komplementar DNK (cDNK) hosil qilishi mumkin. Shuning uchun mRNKni izolyatsiya qilish usullari mavjud bo'lishi kerak.

Turli xil bosqichlar quyidagilardan iborat:

1. Genning oqsil mahsuloti tozalanadi.

2. Antikorlar quyon va sichqon kabi hayvonlarni immunizatsiya qilish orqali ushbu protein mahsulotlariga qarshi ishlab chiqariladi.

3. Maxsus oqsillarni sintez qilish bilan shug'ullanuvchi polisomalarni cho'ktirish amalga oshiriladi. Bu ishlab chiqarilgan antikorlar yordamida amalga oshiriladi.

4. mRNK polisoma fraksiyalaridan ajratib olinadi va tozalanadi. Ushbu mRNK cDNKni sintez qilish uchun ishlatiladi.

5. Keyinchalik bu cDNKlar cDNK kutubxonasini tayyorlash uchun klonlash vektorlariga kiritiladi. Shundan so'ng, o'ziga xos protein uchun genga ega bo'lgan o'ziga xos cDNK klonini aniqlash uchun cDNK klonlarining tarjima mahsulotlarini immunologik va elektroforetik tahlil qilinadi.

6. Keyinchalik to'liq yoki qisman genomik kutubxonani tekshirish orqali genni genomik DNKdan identifikatsiya qilish va izolyatsiya qilish uchun maxsus cDNK problari tanlanadi.

Noma'lum mahsulotlar genini izolyatsiya qilish (to'qimalarga xos ifoda bilan):

To'qimalarga xos bo'lgan gen mahsulotlarini ajratib olish oson. Masalan, oqsillarni saqlash uchun genlar faqat rivojlanayotgan urug'larda, globin geni eritrotsitlarda namoyon bo'ladi. Bunday genlarni osongina ajratib olish mumkin, chunki bunday to'qimalardan olingan mRNK asosan qiziqish geniga aylanadi. Boshqa mRNKni yo'q qilish mumkin, bu gen ifodalanmagan to'qimalardan mRNKni izolyatsiya qilish va solishtirish orqali aniqlanishi mumkin. Keyin bu ajratilgan mRNK teskari transkriptaza fermenti yordamida cDNK sintezi uchun ishlatiladi. Keyin jarayon ma'lum o'ziga xos oqsillarni kodlaydigan genlarni izolyatsiya qilishda tasvirlanganidek bo'ladi.

DNK va RNK zondlari yordamida genlarni izolyatsiya qilish:

Agar maxsus molekulyar problar (DNK va RNK zondlari) mavjud bo'lsa, ular ma'lum genlarni izolyatsiya qilish uchun ishlatilishi mumkin. Ushbu zondlarni boshqa o'simlik turlaridan olish mumkin yoki qiziqish genining protein mahsulotining aminokislotalar ketma-ketligining bir qismi yordamida sun'iy ravishda sintezlanishi mumkin. Bir o'simlik turidan olingan va boshqa o'simlik turi uchun ishlatiladigan zondlar geterologik zondlar deb ataladi.

Ushbu heterolog zondlar koloniyalarni gibridizatsiya qilish yoki blyashka gibridizatsiyasi paytida yoki janubiy dog'da gen klonlarini aniqlashda samarali ekanligi aniqlandi. Misol uchun, antirrhinum majus va Petunia hybrida dan parseldan heterologik zond yordamida xalkon sintaza geni ajratilgan. Geterologik problar odatda cDNK kutubxonasi bilan ishlatiladi.

Endi cDNK problarini sintez qilish bo'yicha bizning bilimimiz bilan bu zondlar sintetik zondlarni sintez qilishda foydali bo'lishi mumkin. Ushbu protsedurada ikki o'lchovli gel elektroforez yordamida tozalangan oqsil ketma-ket 5-15 aminokislotalarni mikro-ketmalash uchun ishlatiladi, bu ma'lumot avtomatlashtirilgan DNK sintezatorlari yordamida mos keladigan oligonükleotidlarni sintez qilish uchun ishlatilishi mumkin. Keyinchalik bu oligonukleotidlar to'g'ridan-to'g'ri cDNK skriningi yoki qiziqish genini izolyatsiya qilish uchun genomik kutubxona uchun ishlatilishi mumkin.



MA `LUMOT

7.12: Genetika Injeneriyasi Vositalari - Biologiya

7.12: Genetika muhandisligi vositalari

Genetika muhandisligining eng yaxshi 4 ta vositasi

Genomik kutubxonani yaratish butun genomik DNKni klonlashni o'z ichiga oladi. Demak, genomik kutubxona bu rekombinant DNK molekulalarining (plazmidlar, faglar) to'plamidir, shuning uchun ushbu to'plamdagi DNK qo'shimchalarining yig'indisi organizmning butun genomini ifodalaydi. Prokaryotik yoki eukaryotik genom hajmiga qarab vektor tanlanishi mumkin. Shunday qilib, butun genom bo'laklarga bo'linishi va vektorlarda yoki PCR texnikasi bilan klonlanishi mumkin. Buni genomik klonlash deb atash mumkin.

Genomik kutubxonani yaratish quyidagi bosqichlarni o'z ichiga oladi:

1. Xromosoma DNKsining izolyatsiyasi

2. DNKning parchalanishi mexanik kesish yoki sonikatsiya yo'li bilan yoki DNKni qisman hazm qilish uchun mos endonukleaza yordamida amalga oshiriladi (15.1-rasm). Mexanik qirqish to'mtoq uchlarini hosil qiladi, endonukleaza esa yopishqoq uchlarni hosil qiladi. To'liq hazm qilishning oldini oladi, chunki u ishlatish uchun juda heterojen bo'laklarni hosil qiladi.

3. DNK bo'laklarini bog'lash - Genomik DNKning qisman hazm bo'lishi zarur o'lchamdagi fragmentlarni ajratish uchun agaroz gel elektroforeziga duchor bo'ladi. Tegishli o'lchamdagi bo'laklar jeldan olinadi. Keyin bu bo'laklar mos vektorga kiritiladi. Bu vektorlar bir xil cheklovchi fermentlar bilan kesiladi. Shundan so'ng DNK fragmentlari DNK ligaza yordamida vektorga bog'lanadi (15.2-rasm). Ushbu texnika yordamida vektorlarga taxminan 25 kb DNK fragmentlarini kiritish mumkin.

4. Istalgan klonni identifikatsiyalash- Koloniyani duragaylashda mos duragaylash probini qo'llash orqali kerakli DNK fragmentini o'z ichiga olgan bakterial koloniyani aniqlash. Zond genning mRNKsi, uning mRNKsining cDNKsi, boshqa organizmning homolog geni yoki kerakli gen/DNK fragmentining bir qismi ketma-ketligini ifodalovchi sintetik oligonukleotid bo'lishi mumkin. Gibridlanishni aniqlash uchun prob odatda radio etiketli izotop bilan etiketlanishi kerak.





Genomik kutubxonani yaratish uchun muqobil vektor tizimlari:

Plazmidlarda gen kutubxonalarini yaratishga yaroqli prokaryotlar (kichik genomlar) uchun. Plazmid qo'shimchalari odatda -5-10 kb, shuning uchun vakillik kutubxonasi uchun faqat bir necha ming rekombinant kerak. Eukaryotlar (kattaroq genomlar) juda kattaroq DNK bo'laklarini ushlab turadigan vektorlarga muhtoj (15.1-jadval).



Lambda bakteriofaglari E. coli infektsiyasini plazmid transformatsiyasiga qaraganda ancha samaraliroq ko'rsatadi. Fag lambda E. coli yuzasidagi retseptorlari bilan bog'lanadi va DNKni in'ektsiya qiladi. Lambda tomonidan infektsiya plazmid transformatsiyasi – olishi mumkin bo'lganidan ancha samaralidir

1 mikrogram DNKga 10 9 ta blyashka

Plazmid DNKning mikrogramiga 10 6 koloniya.

Bakterial hujayralar parchalanishi natijasida blyashka hosil bo'ladi, bu esa ko'proq hujayralar infektsiyalangan va lizis bo'lganda tarqaladi. Blyashka yuqumli virusli zarralar yoki virionlarni o'z ichiga oladi va ularning har biri alohida lambda klonini ifodalaydi (alohida plazmid klonini ifodalovchi bakterial koloniyaga o'xshash).

Tashqi ko'rinishi ‘bulut’ bakterial hujayralar (bakterial ‘lawn’)da aniq doira shaklida (15.3-rasm). Agar uzoq vaqt davomida inkubatsiya qilinsa, bu doiralar o'sishda davom etadi (ko'proq va ko'proq virusli zarralarni o'z ichiga oladi) va barcha bakterial hujayralar yo'q qilinmaguncha tarqaladi. Bitta lambda klonini tanlash uchun blyashka agar plastinadan ‘teshiladi’ va ushlab turuvchi eritmada saqlanadi. Keyinchalik bu ko'proq bakterial hujayralarni yuqtirish va rekombinant lambda DNKsini ko'paytirish uchun ishlatilishi mumkin.



Kattaroq qo'shimchalar bilan kutubxonalar yaratish uchun vektorlar:

Kosmid kutubxonalari katta intronli genlarni klonlash va genomning katta qismlarini ketma-ketlashtirish uchun ishlatiladi. Kosmid vektorlar plazmid va bakteriofag lambda l DNK gibridlaridir (kichik

1. Polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR)



Polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) - bu qiziqarli genlarning bir nechta nusxalarini ko'paytirish jarayoni. kabi termostabil DNK polimerazalarining kashf etilishi Taq Polimeraza laboratoriyada DNK replikatsiyasini manipulyatsiya qilish imkonini berdi. Bu DNK segmentlarining miqdorini oshiradi. Primerlar qiziqish genini aniqlash va ularni ko'paytirish uchun ishlatiladi. Keyinchalik bu nusxalar jel elektroforezi yordamida ajratilishi va tozalanishi mumkin.

2. Cheklovchi fermentlar (molekulyar qaychi)

Cheklovchi endonukleazlar deb nomlanuvchi fermentlarning kashf etilishi oqsil muhandisligi uchun muhim ahamiyatga ega edi. Nukleotidlar ketma-ketligiga asoslanib, bu fermentlar DNKni ma'lum joylarda kesib tashlaydi. Cheklov fermenti bilan kesilgan DNK turli o'lchamdagi ko'plab kichik bo'laklarni hosil qiladi. Ularni jel elektroforezi yoki xromatografiya yordamida ajratish mumkin.

3. Jel elektroforez



Agar biz DNKni tasavvur qila olmasak, DNKni hujayra madaniyatidan tozalash yoki cheklovchi fermentlar yordamida kesish unchalik foyda keltirmaydi. Jel elektroforezi PCR va cheklovchi fermentlar yordamida olingan DNK hajmi va turini tasavvur qilishga yordam beradi. Shuningdek, u DNK qo'shimchalari va nokautlarni aniqlash uchun ishlatiladi.

4. DNK ligaza



DNK ligaza nukleotid zanjirlari o'rtasida kovalent aloqalarni yaratishi mumkin. Bu rekombinant iplarni yaratish yoki cheklovchi fermentlar tomonidan kesilgan dumaloq ipni yopish uchun amalga oshiriladi. DNK polimeraza I va polinukleotid kinaz fermentlari mos ravishda bo'shliqlarni to'ldirish yoki 5' uchlarini fosforlash uchun ham muhimdir

Plazmidlar



Plazmidlar bakterial genomning bir qismi bo'lmagan, lekin o'z-o'zini ko'paytirishga qodir bo'lgan kichik, dumaloq DNK bo'laklari. U mikroorganizmlar o'rtasida genlarni tashish uchun vektor sifatida ishlatiladi. Qiziqarli gen PCR bilan kuchaytirilgandan so'ng, gen va plazmid cheklovchi fermentlar tomonidan kesiladi va birga bog'lanadi. Olingan kombinatsiya Rekombinant DNK deb nomlanadi. Virusli (bakteriofag) DNK dan bakteriofag genlarini o'z ichiga olgan rekombinant plazmidlar bo'lgan kosmidlar kabi vektor sifatida ham foydalanish mumkin.

. Transformatsiya/Transduksiya

Transformatsiya plazmid kabi vektordagi genetik materialni xost hujayralariga o'tkazish jarayonidir. Xost hujayralari atrof-muhit o'zgarishiga duchor bo'ladi, masalan, elektroporatsiya, bu ularni "vakolatli" yoki vektorga vaqtincha o'tkazuvchan qiladi. Plazmid qanchalik katta bo'lsa, uning hujayralar tomonidan qabul qilinishi samaradorligi past bo'ladi.

Kattaroq DNK segmentlari bakteriofag, retrovirus yoki boshqa virusli vektorlar yoki kosmidlar yordamida osonlikcha klonlanadi. Transduktsiya. Faj yoki virusli vektorlar ko'pincha regenerativ tibbiyotda qo'llaniladi, ammo DNKning xromosomalarimizning biz istamagan qismlariga kiritilishiga olib kelishi mumkin, bu esa asoratlarni va hatto saratonni keltirib chiqarishi mumkin.

Transgen organizmlarni aniqlash



Transformatsiya paytida barcha hujayralar DNKni qabul qilmaydi. Shuning uchun transformatsiyaga uchragan va o'tmagan hujayralarni aniqlash juda muhimdir. Umuman olganda, plazmidlar antibiotiklarga qarshilik ko'rsatadigan genlarni olib yuradi va transgen hujayralar ushbu genlarning ifodasi va ushbu antibiotikni o'z ichiga olgan muhitda o'sish qobiliyatiga qarab tanlanishi mumkin. Tanlashning muqobil usullari x-gal/ kabi boshqa reportyor oqsillarning mavjudligiga bog'liq.lacZ mos ravishda rang va floresans asosida tanlash imkonini beruvchi tizim yoki yashil floresan oqsili.