Днк нинг реплекацияси ва транскрипцияси

2. Rekombinant DNK avtonom replikatsiya bo‘lishi uchun javob beradigan DNK bo‘lagi vektor molekulalari deyiladi. Vektor molekulalar o‘z vazifasiga ko‘ra ikki tipga bo‘linadi. Birinchisi avtopom replikatsiya bo‘luvchi vektorlar. Ikkinchisi xromosomaga integratsiya bo‘luvchi vektorlar. Vektor molekulalar gen muxandisligi biotexnologiyasida genlarni klonlashda va transformatsiya qilishda asosiy ish quroli bo‘lib xizmat qiladi.
Vektor molskulalari vazifasini fag DNK lari, plazmidalar va o‘simliklarni xloroplast xamda mitoxondriya DNK lari o‘tashi mumkin. Xo‘jalik ahamiyati qimmatli bo‘lgan genlarni ajratish uchun gen bibliotekasi tuziladi. Xromosomal DNK asosida gen bibliotekasini tuzish quyidagicha amalga oshiriladi: DNK va vektor molekulalar restriktaza fermenti yordamida qirqiladi va ma’lum sharoitda reassotsiatsiya qilinadi. Nukleotidlar orasida ulanmay qolgan bo‘shliq DNK-ligaza fermenti yordamida o‘zaro biriktiriladi. Olingan rekombinant DNK bakteriya hujayrasiga trangformatsiya qilinadi. Xromosomal DNQda mavjud genlarni to‘la klonlash uchun DNK o‘lchamiga va olingan klonlarni soniga e’tibor berish kerak. Bu ko‘rsatgich quyidagi formula yordamida xisoblapadi,
1p (1-)
1p (1-x/u)
bunda:
x-klonlanayotgan DNK o‘lchami), u-gaploid genomning o‘lchzmi va r=0,99 ga teng bulsa 99 ga teng xromosomal DNKning unikal qismi klonlanadi.
Genlarni klonlashda ko‘pincha kDNK bibliotekasini tuzish maqsadga muvofiqdir. Bu holda maxsus poli (Y) va oligo (dT) kolonkalari yordamida uchlarida poli (A) nukleotidlar ketma-ketligini saqlovchi iRNK tRNK va rRNK dan ajratib olinadi. Olingan iRNK molekulasi oligo (dT) nukleotidlari bilan aralashtirilib reassotsiatsiya qilinadi. Bunda iRNK molekulasining poli (A) uchida dA va dT qo‘sh zanjirli segment hosil bo‘ladi. Ushbu ikki zanjirli segmentning oligo (dT) uchi kDNK sintezini amalga oshiruvchi revertaza fermenti uchun praymer (kDNK sintezining boshlanish nuqtasi) vazifasini o‘taydi.
Sintez qilingan kDNK molekulasi qisqa uchli ikki zanjirli struktura bilan tugallanadi. kDNK sintezida matritsa vazifasini o‘tagan iRNK molekulasi NaON bilan parchalanadi natajada qisqa ikki zanjirli va to‘liq iRNK molekulasiga komplementar bo‘lgan bir zanjirli kDNK molekulasi hosil bo‘ladi. Hosil bo‘lgan qisqa ikki zanjirli struktura kDNK ning ikkinchi zanjirini sintez qilishda praymer vazifasini o‘taydi. DNK-polimeraza I !fermenti yordamida kDNKning ikkinchi zanjiri sintez qilinadi. Hosil bo‘lgan kDNKning bir zanjirli qismi SI-nukleaza fermenti yordamida parchalanadi va ikki zanjirli kDNK molekulasi hosil bo‘ladi. Shu yo‘sinda hosil bo‘lgan kDNK molekulasi vektor molskualariga ulangan holda klonlanadi.
Har ikki usu l 6i l an yaratilgan genom bibliotekasidan individual genlarni ajratib olish quyidagicha amalga oshiriladi rekombimant plazmida denaturatsiya qilinadi (100° S haroratda 5min., 0,2n NaON eritmasida 15 min), bir zanjirli DNK molekulasi stabil qo‘zg‘almaydigan holatda turishi uchun nitrosellyuloza filtriga biriktiriladi. Olingan filtr [? ³²R] ATF nukleotidi bilan nishonlangan iRNK molekulasi bilan gibridizatsiya _:qilinadi. Molekulyar gibridizatsiya jarayonida filtrga birikkan rekombinant DNK molekulasiga komplementarlik qonuniyati asosida nishonlangan iRNK molekulalari birikadi.
Hosil bo‘lgan gibrid DNK molekulasi denaturatsiya qilinib nishonlangan iRNK molekulasi (elyutsiya yordamida) ajratib olinadi. Olingan iRNK molekulasi hujayrasiz oqsil sintez qilish tizimida tekshirib ko‘riladi. Hosil bo‘lgan oqsil molekulasining identifikatsiya qilish yo‘li bilan individual genlarni ajratib olishga omalga oshiriladi.