Biotexnalogiya ” kafedrasi 5130200 – “Biotexnalogiy(tarmoqlar bo’yicha)” yo‘nalishi

In kremniy tahlil

U orfolog gen ketma-ketliklar jalb qilingan ichida U biosintez ning rosavin, Rosin va salidrozid ning Arabidopsis taliana, Oryza sativa, P. patens va Zea mays edi KEGG dan olingan ma'lumotlar bazasi

Fenilalanin tirozin



PAL

TyrDC

Transsinnamat tiramin _

4CL
tiramin oksidaza
Cinnamil - CoA 4-gidroksi- fenilasetaldegid





Aryl alcohol dehydrogenase

CCR


Sinnamaldegid tirozol

CAD
+ glyukoza
Cinnamil alkogol Salidroside
+ glyukoza

Rosin

arabinoza +arabinofuranoza

Rosavin Rosarin

Biosintetik yo'l ning rosavin, rosarin va salidrozid sintezi ichida Rhodiola atirgul, fermentlar ichida qutilar edi maqsadli uchun astar dizayn.

Meg-align modul ning DNASTAR [23] edi ishlatilgan uchun bir nechta ketma-ketlik tekislash ning olindi ketma-ketliklar bilan mavjud Rhodiola astar dizayni uchun saqlangan domenlarni aniqlash uchun rosea EST ma'lumotlar bazasi. BatchPrimer3 [24] o'ziga xos 11 genni loyihalash uchun ishlatilgan maxsus sintez qilingan primerlar

astar ID	astar ketma-ketlik (5 >3')	SSR motiv	GC (%)	Yuvish harorat ( ^0C)	Jami raqam ning joylar	raqam ning polimorfik joylar	Foiz ning polimorfik joylar	Jami raqam ning parchalar kuchaytirilgan
CCR_di_f	GTTGTTGAGATTCTGGCTAAG	KT	42.8	50	3	3	100	31
CCR_di_r	ATTGCTTGATGGATGTGAAC		40,0	47
CCR_tri_f	GAGATTCTGGCTAAGCTCTTC	CCA	47.6	52	2	2	100	43
CCR_tri_r	ATTGCTTGATGGATGTGAAC		40,0	47
PAL_f	ATGCTCGTCCGTGTCAAC	CTC	55.5	50	3	3	100	39
PAL_r	GCGATGTAGGAGAGAGGAA		52.6	50
CAD_di_f	ATAATGGGGGACCTTGAA	GA	44.4	45	2	2	100	27
CAD_di_r	TGTAAGTCAGAGTGGCAGATT		42.8	50
ARL_di_f	CTGGACACTGCCTGCTTTT	CG	50,0	47	2	2	100	32
ARL_di_r	GCGCCCACTACTACTGAC		61.1	52
	Jami				12	12		172

DNK qazib olish va Oddiy Ketma-ketlik Takrorlang tahlil
Jami genetik DNK edi qazib olingan dan muzlatilgan barglar (1 g) tomonidan CTAB usuli [25]. o'n bir astar juftlar edi ishlatilgan uchun U o'rganish ning ning 30 genotiplari orasida genetik xilma-xillik Rhodiola rosea . 5 ta primer jufti polimorf edi (1-jadval). Amplifikatsiya reaktsiyasi amalga oshirildi ichida jildlar ning 15ml o'z ichiga olgan 0,83pM ning har biri primer, 0,2 mm ning dNTP aralashtirmoq, 1 mm MgCl2 , _{_} 1.3X PCR bufer va 0,05 birliklar Taq polimeraza ( Sigma-Aldrich, AQSH). U kuchaytirish amalga oshirildi foydalanish Touchdown PCR (Veriti issiqlik velosipedchi, ABI). Birinchi sikl denaturatsiyadan iborat edi shablon DNK da 940 C ^_ 5 uchun min. Denaturatsiya sodir bo'ldi gacha qisqartirildi bitta uchun min U Keyingisi 20 tsikl davomida qaysi U astar tavlanish edi bajarildi da a tushish ning 0,5 ^0C _ uchun bitta min. ergashdi tomonidan astar kengaytma da 72 ^0C _ uchun bitta min. hozir, qachon shablon da tegishli harorat edi kuzatilgan, shablon DNKning denaturatsiyasi amalga oshirildi da 94 ⁰ C haroratda 1 daqiqa, primer tavlanish da Tm ± 2.50C ^_ _ uchun 1.50 min va U astar kengaytma da 72 ^0C _ uchun 2 min. uchun 42 sikllar ergashdi tomonidan final kengaytma 7 uchun 72 ⁰ C da min va PCR mahsulotini saqlash ^40C _ _
Yirtilgan Kuchaytirilgan Polimorf Ketma-ketlik tahlil
Besh qo'shimcha primerlar uchun sintez qilingan U maqsad genlar va DNK kuchaytirgichlar edi amalga oshirildi; bajarildi ichida ellik µL o'z ichiga olgan reaksiya aralashmalari ellik ng DNK, 200 µM dNTPlar, bitta mM ning har biri primer, 0,5 birliklari Taq DNK polimeraza va 1× Taq polimeraza bufer. namunalar edi dastlab denaturatsiya qilingan da uchun 94°C uchun 7 daqiqa va keyin bo'ysundirilgan uchun o'ttiz sikllar ning bitta min da 94°C 2 min da 55°C 3 min da 74 ° C va a final kengaytma da 74°C uchun 7 min. A 5 µL namuna ning PCR mahsulotlar edi alohida hazm qilingan bilan Alu I salom , bgl II, dra I Eko RV, Hind III, hink II, Hinf I, mbo men, avval I, rsa men, xalta I Sau 3AI, Sph I, Taq I va Xba I, 4,0% NuSieve GTG agaroz jeli (BioWhittaker Molecular) bilan ajratilgan ilovalar, toshloq, men, AQSH) elektroforez va vizuallashtirilgan bilan etidium bromid.

Agaroz Jel Elektroforez.
Kuchaytirish mahsulotlar edi elektroforezlangan yoqilgan 2% agaroz gel va da doimiy Kuchlanishi (70V) ichida 1X TAE uchun taxminan 1.5 soat, etidiy bromid (0,5 mkg/ml) bilan bo'yash yo'li bilan tasvirlangan va jami Elektroforezdan oldin har bir reaksiyaga 2 µl yuklash buferi (6X) qo‘shildi. Elektroforezdan so'ng jellar jel hujjatlari tizimida (Biorad) hujjatlashtirildi. Amplikonlarning molekulyar kattaligi edi yordamida taxmin qilinadi 100 bp DNK narvon.
Natijalar va Munozara
Tahlil ning genetik o'zgaruvchanlik
Bu o'rganish hisoblanadi U birinchi ilova ning SSR va KAPS belgilar uchun U baholash ning genetik xilma-xillik ichida R. rosea . U bo'lim ning genetik xilma-xillik foydalanish AMOVA ko'rsatilgan bu genetik xilma-xillik ichida R. roza hisoblanadi tarqatilgan teng ichida va orasida populyatsiyalar. beri aholi genetik tuzilishi ning a turlari hisoblanadi ta'sirlangan tomonidan bir nechta evolyutsion omillar shu jumladan U matlash tizimi, gen oqim, ko'payish usuli va tabiiy tanlanish [30], deb taxmin qilish mumkin R. rosea aralash juftlashish tizimiga ega bo'lishi mumkin, qisman chiqib ketish polen orqali va urug' tarqalish va qisman o'zini tutish tomonidan nihol sajda qilmoq rizomlar. Umuman, U aniqlash ning yuqori darajalar polimorfizm qiladi SSR tahlil a kuchli asbob uchun baholash genetik Rdagi xilma-xillik. Rosea

o'ttiz genotip mintaqalarida kodlash uchun polimorfizmni ko'rsatadigan vakil agaroz jeli R. rosea CCR_di SSR joylari uchun. Raqamlar 3 vodiyning genotiplarini ifodalaydi (bu erda Pop 1- Changla(1-10), Pop 2- Khardungla (11-20) va Pop 3- Khalse (21-30), M: Lambda 100bp+ narvon.

Ortolog primerlar Ladax viloyatining 3 vodiysidan 30 ta genotipda sinovdan o'tkazildi, barcha polimorf primerlar uchun kuchaytirilgan fragmentlar soni gacha bo'lgan 31 (CCR_di) uchun 43(CCR_tri) va hajmi U kuchaytirilgan mahsulot oralig'ida joylashgan orasida 119-200bp hosil bo'ldi 172 parchalar. U 5 polimorfik gen xos primerlar yonboshlash SSR yaratilgan a jami ning 12 polimorfik joylar qaysi 2-3 lokus oralig'ida joylashgan. Polimorf lokuslarning kuzatilgan yuqori ulushi (100%) irsiy o'zgarishlarning yuqori ekanligini ko'rsatadi. Rhodiola genotiplari. SSR belgisi bilan kuzatilgan polimorfizm darajasidan farqli o'laroq, 5 primer 30 R.rosea bo'yicha CAPS tahlili uchun sinovdan o'tkazildi. genotiplar ko'rsatdi yo'q polimorfizm qaysi mumkin bo'l nisbat berilgan uchun yuqori tanlash bosim va mavjudligi ning saqlanib qolgan dagi hududlar ekzonik hududlar ning U gen kabi intergenik bilan solishtirganda hududlar [31,32].


stol 2. Xulosa ning genetik o'zgaruvchanlik statistika ning gen xos belgilar orasida U Rhodiola roza aholi bilan hurmat uchun ularning uchta vodiyda tarqalishi