Матрицага комплементар бўлган ДНКни синтезлаш
учун праймерлардан бири у
билан водород боғини хосил қилиши керак (бу отжиг деб номланади). Лекин, матрица
бундай боғни иккинчи занжир билан хосил қилиб олиши мумкин. Демак, дастлаб ДНКни
қиздириб олиш керак -бунда водород боғлари узилади. Бу иш оддий қиздириш орқали
амалга оширилади (т 95 °С гача) -босқич денатурация деб номланади. Аммо, энди юқори
харорат сабаб праймерлар матрицага боғлана олмайди. Харорат 50-65 °c га қадар
пасайтирилганда праймерлар матрица билан боғланади, шундан сўнг харорат бир оз
кўтарилади (полимеразанинг оптимал ишлаш хароратига қадар, ўртача 72 °c).
Шунда
полимераза матрицага комплементар бўлган ДНК занжирини синтезлай бошлайди -буни
элонгация деб аташади (8-расм). Мана шундай бир босқичдан сўнг керакли фрагментнинг
нусхаси икки карра ортади. Аммо, буни яна бир бор қайтаришга хеч нарса қаршилик
қилмайди. Қайтариш бир эмас бир неча ўн маротаба бажарилади. Хар бир қайтарилишдан
сўнг мавжуд ДНК фрагментининг миқдори икки маротабага ортиб бораверади, чунки янги
хосил бўлган молекулалар кейинги сикл учун матрица сифатида қўлланилади (9-расм).
Аслини олганда ПЗРнинг эффективлиги у қадар юқори эмас,
идеал холатда эса шундай,
реал сонлар ҳам шунга яқинроқ бўлади.
ПЗР натижаларини жуда тез кўриш мумкин: ПЗРдан сўнг реакцион қоришмани
электрофорездан ўтказиш кифоя, олинган нусхалар мавжуд ѐрқин чизиқ кўринади.
Қиздирилганда инактивацияланувчи полимеразани илгари хар сиклда қўшишга
тўғри келар эди, лекин кейинчалик термофил бактериялардан
ажратиб олинган
термостабил полимеразалардан
фойдаланила бошланган, у қиздириш жараѐнларига
осонлик билан бардош берганлиги сабабли, ПЗРни амалга ошириш жараѐни кучли
даражада соддалашди (кўпинча
Тhermophilus aquatius бактериясидан ажратиб олинган
Тақ-полимеразадан фойдаланилади).
Реакция қоришмасидаги сувнинг кучли даражада буғланишини олдини олиш учун
унинг юза қаватини қоплаб турувчи мой қўшилади, ва\ѐки термосиклер (ПЗР жараѐни
ўтказилувчи қурилма) қиздирилувчи қопқоғидан фойдаланилади. У пробиркалар
хароратини тезлик билан ўзгартирганлиги сабабли, уларни бир термостатдан бошқасига
кўчириб ўтказишга зарурат қолмайди. Қиздирилгунга қадар, хусусан сикл бошлангунича
специфик бўлмаган синтезнинг олдини олиш учун кўп холларда "Қайноқ стартли"
ПЗР.дан фойдаланилади: барча ДНК ва полимераза ўзоро парафин қавати билан
ажратилади, у юқори хароратда буғланиб, керакли шароитда уларнинг ўзоро
та`сирлашувига имкон яратади. Баъзида эса
паст хароратда ишламайдиган,
модификацияга учраган полимеразалар қўлланилади .
ПЗРнинг турли ҳил нозик томонлари хақида яна кўплаб гапириш мумкин, аммо,
натижаларни аниқловчи классик форезга алътернатив бўлган усуллар хақида тўхталиш
мухимроқ саналади. Мисол учун, реакция бошланишидан
аввал реакция амалга ошувчи
пробиркага ДНК мавжуд шароитда флуоресценцияланувчи моддаларни қўшиш очиқ
кўринувчи вариантлардан бири саналади. Бунда дастлабки ва сўнгги флуоресценцияни
ўзоро солиштириш орқали ДНКнинг миқдори ортган ѐки ортмаганлигини билиш мумкин
бўлади. Лекин бу усул специфик эмас: биз айнан керакли ДНК фрагменти
синтезланганми ѐки бўлмаса қандайдир праймерлар ўзоро ѐпишиб, бошқариб
бўлмайдиган даражада кетма -кетликларни хосил қилиб
олганлигини айтиб бера
олмаймиз.
"Реал вақт"даги ПЗР ("real-time PCR") нисбатан қизиқ вариант саналади. Бу
усулни амалга оширишнинг бир қанча йўллари мавжуд, лекин барчасида ҳам ғоя бир ҳил:
тўғридан -тўғри реакция бориш жараѐнида махсулот йиғилиб боришини кузатиб бориш
мумкин (флуоресценция орқали). Мос равишда, "реал вақт"да
ПЗРни амалга ошириш
учун хар бир пробиркадаги флуоресценцияни қўзқатиш ва хисоблаш имконига эга бўлган
махсус анжом керак бўлади. Бунинг энг осон ечими -ДНК мавжуд шароитда
флуоресценцияланувчи моддаларни пробиркага қўшиш хисобланади. Аммо ушбу
усулнинг минус томонлари юқорида такидлаб ўтилди.
"Реал вақт"даги ПЗР - қат`ий тарзда "реал вақт режимидаги флуоресценцияни қайд
қилиш билан борувчи ПЗР" ѐки "миқдорий ПЗР" деб номланади.
Do'stlaringiz bilan baham: 
