«Биохилма-хилликни сақлаш ва ривожлантириш» Республика илмий-амалий анжумани

«Биохилма-хилликни сақлаш ва ривожлантириш» Республика онлайн илмий-амалий анжумани
Гулистон 2020 й. 17-18 апрель
372 
18.
ДНКли чўкмани 70%ли 1 мл этил спиртида 2 марта ювиб, 12000 айл/мин 
тезликда 5 минут давомида центрифугаладик ва этил спиртини ажратиб 
олдик;
19.
Сўнгра чўкмани 37°C ли вакуумли концентраторда қуритдик ва қуритилган 
ДНКни ТЕ буферда эритдик.
Ажратиб олинган ДНК концентрациясини бромли аралашма билан 
краскалаб, 0,9%ли агарли гелда маълум концентрацияли йўлакчалар ҳосил 
бўлиш ҳолатига (Остерман Л.А., 1981) кўра аниқладик. ДНК эритмалари 
намуналарини ишчи концентрациягача бўлган ҳолатда (25 нг/мкл) суюлтириб, -
20°C ҳарортада кейинги тадқиқотларда фойдаланиш учун сақладик. 
Тадқиқотларимиз давомида тажриба ва назорат вариантдаги буғдой 
ниҳолларининг баргидан тайёрланган экстрактлар суюлтирилган ДНКсини 
RAPD (Random Amplified Polymorfic ДNA), ISSR (Inter-Simple Sequence 
Repeats) маркерлардан фойдаланган ҳолда кўпайтириш учун ПЦР 
амплификаторга ўтказдик. Бунда ҳар бир вариант реакция икки маротабалаб 
амалга оширилди. 
ПЦР-RAPD амплификация жараёни умумий реакцион аралашма 20 мкл 
ҳажмдаги эритмада ўтказилди. Бунда аралашмада 20 нг геном ДНК бўлиб, 
таркибида 0,8 М Трис-HCl, 0,2 М (NH
4
)
2
SO
4
ва 0,2% w/v Tween-20, 2,5 мМ 
MgCl
2
1U FIREPol® ДНК-полимераза, 0,2 мМ dNTP аралашмаси (Invitrogen) ва 
0,4 µM OPB05 primer бўлган 1×ПЦР-буферни ташкил этди. 
RAPD амплификацияси жараёни бошланғич ҳолдаги денатурацияси 
94°Сда 2 мин; 45 циклли 94°С даги денатурацияси 1 мин., 36°С даги аралашиш 
ҳолати 1 мин, 72°С даги давомийлиги 2 мин ва сўнги 72°С даги давомийлиги 7 
мин.ни ташкил этди. ПЦР-RAPD ёрдамида кўпайтирилган манбани 1,5%ли 
агароза гели ёрдамида 1 Kb РНК занжири (Bio-Rad) билан 1×TBE буферида 90В 
кучланишда 1 соат давомида ажратдик. ПЦР-ISSRда ампликация жараёнини 20-
µl ҳажмли реакцион аралашмада ўтказдик. Аралашманинг умумий таркибини 
50 ng ДНК, 0,8 М Трис-HCl, 0,2М (NH
4
)
2
SO
4
ва 0,2%ли w/v Tween-20, 2.5 mM 
MgCl
2
ва 1U of FIREPol® ДНК полимераза, 0.2 mM dNTP аралашма 
(Invitrogen), 0.4 µM ISSR-UBC 810 primer (GA)
8
Tдан иборат буферни ташкил 
этди. 
ISSR ампликация жараёни бошланғич ҳолда 94
0
Cда 2 мин давомида 
денатурацияланиш билан ўтказилди; 35 циклли денатурация 94
0
C да 1 мин 
давомида, парчаланиш жараёни 47
0
Cда 1 мин.да, узайтирилиши 72
0
C да 2 мин 
ва якуний узайтирилиш жараёни 72
0
Cда 7 мин.ни ташкил этди. ПЦР-RAPD 
ёрдамида кўпайтирилган манбани 2%ли агароза гели ёрдамида 1 Kb ДНК 
занжири (Bio-Rad) билан 1×TBE буферида 90 В кучланишда 1 соат давомида 

---