Amaliy mashg’ulot 9 Mavzu: Sekvenirlash usullari Mashg’ulotning maqsadi

Download 20,07 Kb. bet 2/2 Sana 23.06.2022 Hajmi 20,07 Kb. #696375

Bog'liq
9 Amaliy mashg’ulot

Bu sahifa navigatsiya:

• IRDye Primer (1 pmol/µl) 1,5 µl DNK
• Cycle Sequencing Polimerase 0,65 µl Umumiy hajmi
• Olingan bilim va malakadan kelajak ish faoliyatda foydalanish

ddH20 (MilliQ)
8,25 µl
10x Bufer	2,6 µl
IRDye Primer (1 pmol/µl)	1,5 µl
DNK	pastga qarang
Cycle Sequencing Polimerase	0,65 µl
Umumiy hajmi	13 µl

Reaksiya uchun zarur bo'lgan DNK miqdori: DNKni har 1000 zarba uchun 50-250 fmol yoki 30-150 ng olish kerak. Bunday holda, kamroq matritsani olish yaxshiroqdir (pastki chegara bo'ylab)

3) 2-bosqichda olingan aralashmani yaxshilab aralashtiramiz va dideoksinukleotid terminatorlari bilan eppendorflarga 3 mkl ni to'kib tashlang (qo'shilgandan keyin aralashmani yaxshilab aralashtiring; pufakchalar paydo bo'lishidan saqlaning, har safar uchini o'zgartiring).
4) Olingan ependorflarni amplifikatorga joylashtiring. Kerakli dasturni ishga tushiring.
5) Dastur oxirida reaktsiyani imkon qadar tezroq to'xtatish kerak. Buning uchun har bir Eppendorfga 3 µl IR2 Stop Solution (Cor) qo‘shing.
6) Keyinchalik, namunalar muzlatgichga / muzlatgichga joylashtiriladi. Namunalarni gelga yuklashdan oldin darhol ularni 92 ° C da 3 minut davomida denatüratsiya qilish kerak. Dastur tugagandan so'ng, namunalarni darhol qor/muzga joylashtiring.
Birlamchi denaturatsiya - 92°C 3 min
Denaturatsiya - 92 ° C 30 sek 30 tsikl
Otjig - Tm-5°C 30 sek
Elongatsiya - 70 ° C 1 min
Saqlash - 4 ° C haroratda
Bizda mavjud bo'lgan M13 primerlari uchun tavlanish harorati 49 ° C ga o'rnatildi. Primer erish harorati (Tm) formula bo'yicha aniqlanadi: 69,3 ° C + 0,41x - 650 / primer uzunligi, bu erda x - primerdagi GC nukleotidlarining ulushi. v)
Namuna saqlash
gelga yuklashdan oldin reaktsiyani to'xtatgandan so'ng, namunalar muzlatgichda yoki muzlatgichda eng yaxshi saqlanadi. Noma'lum muddatga kechiktirilgan namunalar muzlatgichda (-20 ° C) bir haftadan ko'p bo'lmagan muddatda saqlanishi kerak (bundan keyin ketma-ketlik reaktsiyasini qayta boshlash kerak).
Olingan bilim va malakadan kelajak ish faoliyatda foydalanish:
Аmaliy mashg’ulotda sekvenirlash usullari haqida to’liq ma’lumotga ega bo’linadi. Olingan bilim va malakalardan genomikaning turli sohalarida izlanishlar olib borilgandagi faoliyatda foydalaniladi.
Nazorat savollar:

1. 
   Sekvens nima?
   
2. 
   Sekvens ning qanday turlari farqlanadi?
   
3. 
   Sekvens bilan genotiplash farqini ayting?
   

Download 20,07 Kb.

Do'stlaringiz bilan baham: