2. Yuqori samarali suyuqlik xromotografiyasi tarkibi Yuqori samarali suyuqlik xromotografiyasi samaradorligi va selektevligi

Teskari fazali xromatografiya
Teskari fazali HPLC (teskari fazadan RP-HPLC - teskari faza ) qutbsiz statsionar faza va qutbli (suvli) erituvchilar yordamida amalga oshiriladi .  Statsionar faza an'anaviy silikagel bo'lib, u RMe _{2 SiCl bilan sirt o'zgartirilgan, bu erda R C 18} H ₃₇ yoki C ₈ H ₁₇ kabi to'g'ri zanjirli alkil guruhidir . Shunga ko'ra, RP-18 va / yoki RP-8 materiali bo'lgan ustunlar ajralib turadi. Shunga o'xshash statsionar fazalar bilan kamroq qutbli molekulalar uchun ushlab turish vaqtlari uzoqroq bo'ladi , qutbli molekulalar tezroq elute bo'lsa (ilgari analitik HPLCda). Mobil fazaga ko'proq suv qo'shish orqali ushlab turish vaqtini oshirish mumkin, shuning uchun hidrofobik analitning hidrofobik statsionar fazaga yaqinligi hozirgi ko'proq hidrofilik harakatlanuvchi fazaga nisbatan kuchliroq bo'ladi . Xuddi shunday, eluentga ko'proq organik erituvchi qo'shish orqali ushlab turish vaqtini qisqartirish mumkin (mobil faza). Teskari fazali HPLC shunchalik tez-tez ishlatiladiki, u ko'pincha noto'g'ri, hech qanday qo'shimcha belgilarsiz oddiy HPLC deb ta'riflanadi. Dorixonada teskari fazali HPLC dori vositalarini chiqarilishidan oldin tahlil qilish uchun majburiy usul sifatida qo'llaniladi.

Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi xromatogrammasi. Tahlil qilingan modda parfyumdir. C18 ustunida ajratish. Gradient: 5-100% ACN suv.

Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi suv molekulasining dipol tuzilishidagi yuqori simmetriya tufayli yuzaga keladigan gidrofobik o'zaro ta'sirlar printsipi asosida ishlaydi va hayot haqidagi fanlardagi barcha jarayonlarda eng muhim rol o'ynaydi. RP-HPLC ushbu o'zaro ta'sir kuchlarini o'lchaydi. 
Tahlil qiluvchining statsionar (statsionar) faza bilan bog'lanishi analit molekulasining statsionar faza ligand bilan qutbsiz segmenti atrofidagi aloqa yuzasiga proportsionaldir. Ushbu solvofobik ta'sir ikkalasining kompleksiga nisbatan analit va C18 zanjiri atrofidagi "bo'shliqlarni kamaytirish" uchun suvning kuchi bilan ustunlik qiladi. Bu holda chiqarilgan energiya sirt tarangligiga proportsionaldir.Eluent (suv: 7,3×10−6 J/sm², metanol: 2,2×10−6 J/sm²) va mos ravishda analit va ligandning hidrofobik yuzasi. Suvning sirt tarangligini kamaytirish uchun harakatlanuvchi fazaga kamroq qutbli erituvchi (metanol, asetonitril) qo'shish orqali moddaning ustunda ushlanishini kamaytirish mumkin. Solvent gradienti tahlil paytida suvli mobil fazaning polaritesini va sirt tarangligini avtomatik ravishda kamaytirish orqali bu ta'sirdan foydalanadi.
Analit molekulasining strukturaviy xossalari uni statsionar fazada ushlab turish xususiyatlarida muhim rol o'ynaydi. Umuman olganda, katta hidrofobik qismga ega bo'lgan (C-H, C-C va odatda SS va boshqalar kabi qutb bo'lmagan atomik aloqalar) analit suv yuzasi bilan o'zaro ta'sir qilmagani uchun uzoqroq saqlanadi.
Boshqa tomondan, strukturasida katta qutbli qismlarga ega bo'lgan tahlil qiluvchi moddalar (ularning tuzilishida -OH, -NH ₂ , COO ^- yoki -NH ₃ ⁺ kabi qutbli guruhlar mavjud.) kamroq saqlanadi, chunki ular suv bilan yaxshi bog'lanadi. Bunday o'zaro ta'sirlar sterik ta'sirga duchor bo'lishi mumkin: juda katta molekulalar faqat sirt ligandlari (alkil zanjirlari) bilan o'zaro ta'sirlar sodir bo'ladigan statsionar fazaning teshiklariga cheklangan kirishi mumkin. Bunday sirt obstruktsiyasi odatda ushlab turishning pasayishiga olib keladi.
Gidrofobik (polyar bo'lmagan) sirt maydoni ortishi bilan ushlab turish vaqti ortadi. Tarmoqlangan zanjirli birikmalar ularning mos chiziqli izomerlariga qaraganda ancha tez yuviladi, chunki umumiy sirt maydoni kamayadi. Yagona C-C bog'lari bo'lgan o'xshash organik birikmalar C=C yoki uch marta C-C bog'lari bo'lgan shunga o'xshash birikmalarga qaraganda kechroq yuviladi, chunki ikki yoki uch bog'lanish bitta C-C bog'idan qisqaroqdir.
Harakatlanuvchi fazaning sirt tarangligidan qat'iy nazar (elyuentning strukturasidagi tashkiliy quvvat), harakatlanuvchi fazaning boshqa xususiyatlari tahlil qiluvchi moddaning ushlab turish vaqtiga ta'sir qilishi mumkin.
Masalan, noorganik tuzlarning qoʻshilishi suvli eritmalarning sirt tarangligining oʻrtacha chiziqli oshishiga olib keladi ( NaCl uchun Mol uchun taxminan 1,5⋅10 ⁻⁷ J/ sm², (NH _{4 ) uchun Mol uchun 2,5⋅10} ⁻⁷ J/sm² ) ₂ SO ₄) va tahlil qilinadigan eritmaning entropiyasi sirt tarangligi bilan boshqarilganligi sababli, tuzlarning qo'shilishi ushlab turish vaqtining oshishiga olib keladi. Shunga o'xshash usul oqsillarni muammosiz ajratish va tiklash va oqsillarni tahlil qilishda ularning biologik faolligini himoya qilish uchun qo'llaniladi (bu usul hidrofobik o'zaro ta'sir kromatografiyasi, HIC deb ataladi).

HPLC (HPLC) uchun xromatografik ustun. Chap tomonda A va B nasoslari ko'rinadi, yuqorida yuvish valfi, pastda halqa va namunani kiritish joyi mavjud.
Yana bir muhim omil - bu mobil fazaning pH darajasi , chunki u tahlil qiluvchi moddaning gidrofobik xarakterini o'zgartirishi mumkin. Buning uchun ko'p usullar pHni nazorat qilish uchun natriy fosfat kabi tamponlovchi vositadan foydalanadi. Bufer eritmalar bir nechta maqsadlarga xizmat qiladi: pH ni nazorat qiladi, silikagel yuzasida statsionar fazaning zaryadini neytrallaydi va tahlil qilinadigan moddaning zaryadini neytrallash uchun ion juftlashtiruvchi moddalar sifatida ishlaydi. Ammoniy formati ko'pincha massa spektrometriyasida analit-ammoniy qo'shimchalarini hosil qilish orqali ma'lum analitlarni aniqlashni yaxshilash uchun ishlatiladi . Sirka kislotasi yoki ko'proq chumoli kislotasi kabi uchuvchi organik kislotalarko'pincha ko'chma fazaga qo'shiladi, agar massa spektrometriyasi ustunning elyutuvchi komponentini tahlil qilish uchun ishlatilsa. Trifloroasetik kislota detektor va erituvchi bilan ta'minlash tizimida qolishi sababli massa spektrometriyasida tez-tez ishlatilmaydi. Biroq, u karboksilik kislotalar kabi analitlarni ushlab turishni yaxshilashda samarali bo'lishi mumkin.
Kislotalar va bufer eritmalarning ta'siri foydalanish turiga qarab farqlanadi, lekin umuman olganda ular xromatografiya natijalarini yaxshilaydi.
RP-HPLC ustunlari oddiy silika ustunlari bilan solishtirganda shikastlanishi nisbatan qiyin. Biroq, ko'plab RP ustunlari silika jelining alkil hosilalaridan iborat bo'lib, suvli asoslar bilan foydalanish qat'iyan man etiladi, chunki ular silikagelning asosiy zarralarini yo'q qiladi. 
Ular kislotalarning suvli eritmalari bilan ishlatilishi mumkin, ammo ustun uzoq vaqt davomida kislotalarga ta'sir qilmasligi kerak, chunki bu HPLC apparatining metall qismlarini korroziyaga olib kelishi mumkin.
RP-HPLC ustunlari qoldiq kislotalar va tamponlarni olib tashlash uchun ishlatilgandan keyin toza erituvchi bilan yuvilishi va “tegishli erituvchi”da saqlanishi kerak (masalan, metanol bilan yuvib tashlang va ustunga havo kirmasligi uchun nasos shlanglarini spirtda qoldiring) . HPLC ustunlarining metall tarkibi past bo'lishi kerak, agar moddalarni eng yaxshi tarzda ajratish qobiliyatini saqlab qolish zarur bo'lsa. Ustundagi metall miqdori uchun yaxshi sinov 2,2'- va 4,4'-bipiridin aralashmasini o'z ichiga olgan namunani kiritishdir (bipiridin ). 2,2'-bipiridin metallar bilan xelatlanishi mumkinligi sababli, silikagel yuzasida metall ionlari mavjud bo'lsa, 2,2'-bipiridinning tepalik shakli buziladi ("dum" bilan).
HPLC uchun matritsalar 
HPLCda ishlatiladigan matritsalar silika ( silikagel ) yoki alumina kabi noorganik birikmalar yoki polistirol (divinilbenzol bilan o'zaro bog'langan) yoki polimetakrilat kabi organik polimerlardir . Silika gel, albatta, endi umumiy qabul qilinadi.
Matritsaning asosiy xususiyatlari:

• 
  Zarrachalar hajmi (mkm);
  
• 
  Ichki gözenek hajmi (Å, nm).
  

HPLC uchun silikagelni olish:

1. 
   Polisilik kislotaning mikrosferalarini hosil qilish;
   
2. 
   Silika jel zarralarini quritish;
   
3. 
   Havoni ajratish.
   

Sorbent zarralari:

• 
  Muntazam (sferik): yuqori bosim qarshiligi, yuqori narx;
  
• 
  Sferik bo'lmagan: past bosim qarshiligi.
  

HPLCdagi g'ovak hajmi eng muhim parametrlardan biridir. Teshik hajmi qanchalik kichik bo'lsa, ularning elimitatsiya qilingan moddalar molekulalari uchun o'tkazuvchanligi shunchalik yomon bo'ladi. Va shuning uchun sorbentlarning sorbsiya qobiliyati shunchalik yomon bo'ladi. Teshiklar qanchalik katta bo'lsa, birinchidan, sorbent zarralarining mexanik barqarorligi past bo'ladi, ikkinchidan, sorbsiya yuzasi qanchalik kichik bo'lsa, shuning uchun samaradorlik yomonlashadi.
Statsionar fazali payvandlash 
Oddiy fazali HPLC:

• 
  Propilnitril (nitril) bilan payvandlangan statsionar faza;
  
• 
  Propilamin payvandlash (amin) bilan statsionar faza.
  

Teskari fazali HPLC:

Alkil grefti bilan statsionar faza;
Alkilsilil grefti bilan statsionar faza.
Oxirgi qopqoq - "kichik" molekulalar bilan qo'shimcha payvandlash orqali payvandlanmagan sorbent joylarini himoya qilish. Hidrofobik so'nggi qopqoq (C1, C2): yuqori selektivlik, yomon namlanish; Hidrofilik so'nggi qopqoq (diol): past selektivlik, yuqori namlanish.
HPLC detektorlari 

• 
  UV
  
• 
  Fotodiodlar qatori
  
• 
  Florimetrik
  
• 
  Elektrokimyoviy
  
• 
  Refraktometriya
  
• 
  ommaviy selektiv