Нишонланган моддаларга асосланган усуллар.
Бу усуллар АТ ёки
АГ ни бирорта модда (фермент, радиактив моддалар)
билан нишонлашга
асосланган булиб, вирус миқдори кам бўлган ҳолларда ҳам аниқлай олади. ()
[Мухаммедов 2002, Қодирова, 1991, Жураева 1996] Усулнинг қуйидагича
турлари мавжуд:
1. Радиоиммун анализ усули (РИА). Бу усулда бирорта вирус АТ си
радиоактив йод (I
125
ёки I
131
) билан нишонланади. Унинг моҳияти куйидагича:
аввал қаттиқ фазага (полистрол платаларга) вирус АТ лари иммобилизация
қилинади ва ундан сўнг АГ солинади ва маълум вақтдан сўнг йод билан
нишонланган АТ лар солинади. Бу усулларни биринчи бўлиб
фитовирусологияда Болл 1973 йилда қўллаган. Усулнинг сезгирлиги 0,5
мкг/мл дан то нанограммагача (1 нг - 0,000000001г) [Мухаммедов, 2002;
Ваҳобов, 2004].
2. Флуоресцент зондлар усули. Бу
усулда люминессцент нишони
аниқламоқчи булган вирус АТ си таркибига киритилади ва фақатгина
вируснинг миқдорини аниқлашдан ташқари касалланган ўсимлик
тўқималарида жойлашган ўрнини ҳам аниқлаши мумкин [Жураева 1996;
Вахобов 1991].
3. Иммунофермент анализи (ИФА). Кейинги йилларда нишон сифатида
биокатализаторлар яъни фермент ишлатилмоқда. Бу фермент реакциянинг
молекуляр кучайтиргич булиб хизмат қилади. ИФА микроорганизмларини,
вирусларни, айниқса фитовирусларни аниқлайдиган энг сезгир иммунологик
усул ҳисобланади [Вахобов 2004].
ИФА усули 70 йиллар бошларида Швециялик олим Engvell ва
Рerlmann, Голландиялик Weemen Schuur, АКШлик
олимлар Rubenstein лар
ҳамкорликда ишлаб чиқишган бўлиб, АГ ва АТ орасидаги муносабатга
асосланган [Фримеля, 1987]. Кейинчалик (1976) Адамс ва Кларк ўсимлик
вирусларини аниқлашда биринчи бўлиб қўллаган [Ваҳобов, 1991, 2004]. Бу
усулнинг сезгирлиги жуда юқори яъни вирусларни жуда кам миқдорда ҳам
аниқлаш имкониятига эга. ИФА РИО усулига ўхшаш. Лекин бунда
радиоактив изотоп ўрнига фермент ишлатилади [Испуллаев, 2008].
Ҳозирда ИФАнинг турлари жуда кўп: гамоген, гетероген, бир
босқичли, икки босқичли, нишонланган
антиген ва антителалар билан,
нафақат антитела, балки антигенларни ҳам рақобат ва рақобатсиз усуллар
ёрдамида аниқлаш мумкин [Мухамедов, 2002].
Фитовирусологияда ИФАнинг қуйидаги асосий турлари қўлланилади:
1. “Тўғри” вариант бунда микроплаталарга иммуноглобулинглар
ёпиштириб ўтирмасдан тўғридан-тўғри аниқланадиган вирус (АГ)
ёпиштирилади, устидан АТ канюгат ва охирги босқичда субстрат қуйилади.
2. Сендвич вариант бу вариантда дастлаб
микропласталарга специфик
АТ сенсибилизацияланади, ундан сўнг ортиқча АГ ювиб ташланади.
Планшетлар қуритилгандан сўнг канюгат қуйилади ва энг охирги босқичда
субстрат қуйилади.
3. “Нотуғри” вариант. Бу усулда платаларга АТ сенсибилизация қилиб
ёки қилмасдан ҳам ишлатиш мумкин. Фермент билан иммуноглобулинлар
эмас АТ нишонланади [Таленский 1987, Вахобов 2004, Кодирова 1992]. ИФА
нинг турлари ичида сендвич варианти яъни ELISA (ELISA- encyme linked
immunosorbent assay) номли қаттиқ асосли тури кенг қўлланилмоқда.
Бу усулда вирусларни диагностика қилиш
учун дастлаб АТ органик
табиатли (поливинилхлорид ёки полистирол) планшетларга адбсорбция
қилинади. Ортиқча АТ лар ювиб ташланади. Сўнг текширилаётган ўсимлик
шираси АГ солинади ва маълум муддат инкубация қилинади. Ундан сўнг
ортича АГ ювиб ташланиб, қуритилгандан сўнг планшетга коньюгат
(лотинча coniuugatio - бирлашиш) АТ +фермент (пироксидаза, ишқорли
фосфотаза, галактозидаза) адсорбция қилинади. Ортиқча конюгат ювиб
ташлангандан сўнг субстрат (ортофенилдиамин ёки титрометилбензидин,
паранитрофенилфосфат)
солиниб
инкубация
қилинади,
субстрат
иммуноглобулинларга бириктирилган ферментни фаоллаштиради. Агар
ўсимликда вирус бўлса ранг ўзгариши кузатилади ва вирус миқдорига қараб
ранг ўткирлиги фарқ қилади. Бу усул
бутербродони эслатгани учун
“сендвич”(Sandivich) усули деб аталади [Ваҳобов, 2004, Мухаммедов, 2002
Тальянский ,1987].
Шундай қилиб бугунги кунда фитовирусларни диагностика қилишда
ишлатиладиган
индикатор
ўсимликлар,
электронмикроскопия
ва
иммуналогия каби усуллар қўлланилади. Бу усуллар ичида сезгирлиги, кам
ишчи кучи талаб қилиши ва бир вақтнинг ўзида бир қанча намунани
текшира олиши билан иммунология усулларининг
ичида ИФА етакчи
ўринни эгаллайди.
